乙型肝炎病原学诊断进展

小小刘

南方医科大学南方医院 侯金林 陈金军
来源：国际肝病作者：侯金林,陈金军发布时间：2008-5-6阅读：191
文章导读：乙型肝炎病毒感染仍然是我国一个非常严峻的健康问题。虽然近10余年抗-HBV治疗药物推陈出新、策略日新月异、试验性研究结果层出不穷，主要的问题仍没有很好地解决：例如，如何选择疗效评价的最适替代标志（optimal surrogate marker）、如何提高干扰素治疗应答率、是否可以给核苷（酸）类似物治疗制订确定的治疗期限、如何预防和减少以及更早发现耐药突变等等。HBV病原学，包括病毒核酸和抗原的检测，对回答和解决上述问题不可或缺。下面分别就HBV病毒核酸和抗原检测方面的进展作一个简单总结。
乙型肝炎病毒感染仍然是我国一个非常严峻的健康问题。虽然近10余年抗-HBV治疗药物推陈出新、策略日新月异、试验性研究结果层出不穷，主要的问题仍没有很好地解决：例如，如何选择疗效评价的最适替代标志（optimal surrogate marker）、如何提高干扰素治疗应答率、是否可以给核苷（酸）类似物治疗制订确定的治疗期限、如何预防和减少以及更早发现耐药突变等等。HBV病原学，包括病毒核酸和抗原的检测，对回答和解决上述问题不可或缺。下面分别就HBV病毒核酸和抗原检测方面的进展作一个简单总结。


一、病毒核酸检测

1.血清HBV 核酸定量检测：目前的口服抗-HBV药物均以抑制HBV复制，即血清HBV DNA定量水平的降低为评价指标[1]。血清HBV DNA定量方法目前多以聚合酶链式反应（PCR）作为检测手段；HBV DNA定量的表达多以拷贝/ml或IU/ml表达，二者之间粗略的换算方法为1 IU/ml = 5 拷贝/ml。血清HBV DNA定量检测的发展方向为更高敏感性（sensitivity）和更宽的动态范围（dynamic range）。例如罗氏公司的Cobas Taqman（敏感性为60IU/ml，动态范围可至108IU/ml）[2,3]，目前刚完成或正在进行的临床试验多采用此方法，并将HBV DNA下降速率作为疗效的评价指标[1]。雅培公司RealTime方法的检测范围与前者类似，检测下限可达10 IU/ml[4]。

可以设想，应用上述两种方法，或许可以更早地监测到接受抗病毒治疗患者血清HBV DNA的波动甚至是反弹（minor fluctuation或minor rebound），将对提高HBV耐药预警有帮助。上述两种较国内目前普遍应用的方法有更高的敏感性，如果广泛在临床应用，之前诊断的非活动性HBsAg携带者（Inactive carrier）将面临修正诊断的问题。更敏感的方法可能带来的益处，包括对HBV感染者的管理，抗病毒治疗效果的评价以及后续治疗策略的影响等方面都需要基于循证医学的研究来全面探讨；但是高昂的成本将是这类方法在国内开展和应用的最大障碍；另外，HBV DNA检测阴性（低于检测下限）并不能作为抗-HBV治疗终点。

另外，也有报告认为血清中HBV DNA的定量检测可以作为预测拉米夫定耐药的标志之一[5]；或许可为HBV核酸检测在临床诊断尤其是对治疗的评价等方面的作用提供新的研究思路。

2.HBV 共价闭合环状DNA（cccDNA）定量检测：目前的抗病毒治疗无法彻底清除HBV cccDNA在肝细胞中的持续存在，是停药后肝炎再活动的决定性因素。有较多关于HBV cccDNA定量检测方法的报告，所有方法均依据松弛环状DNA和cccDNA在结构上的差异而设计，一些报告还采取酶消化的附加步骤以减少松弛环状DNA相对于cccDNA的比例以增加特异性[6-8]。即便如此，目前的HBV cccDNA定量方法仍存在过高估计cccDNA水平的问题。有些方法甚至可以检测到血清中极高拷贝数的HBV cccDNA，这和一般的看法差别太大却没有合理的解释[6,9]；另外，在观察抗病毒治疗对HBV cccDNA的作用时，体外采用传统的氯化钾沉淀法得出的结果认为抗病毒治疗无法降低HBV cccDNA的水平，与上述定量方法的体内结果（可以降低几十倍甚至上百倍）截然不同[10]。这说明目前HBV cccDNA的定量检测方法在特异性的提高上仍有空间；同时采用目前的HBV cccDNA定量方法可能会对HBV生活周期的认识以及抗病毒治疗的策略制定产生误导，值得警惕。再考虑到肝脏活检的不普遍性，HBV cccDNA定量的临床应用目前仍不现实。

3.耐药相关的突变检测：影响核苷（酸）类似物治疗慢性乙型肝炎疗效的主要问题是耐药，包括交叉耐药。耐药检测的方法包括简单易行的限制性片段长度多态性分析方法（RFLP）、直接测序或克隆后测序，以及谱线探针方法（line-probe）或限制性片段质谱多态性（restriction fragment mass polymorphism）等方法，国内各单位的临床检测方法则是各显神通。

之前认为阿德福韦（类）和拉米夫定、恩替卡韦以及替比夫定不存在共通的耐药通路，但最近的临床观察和研究证实，拉米夫定治疗时出现的逆转录酶（reverse transcriptase, rt）181位氨基酸变异会导致对阿德福韦的敏感性明显下降，导致阿德福韦治疗失败[11]。因此在监测拉米夫定耐药时同时要测定YMDD区域以外的序列。随着研究的深入，越来越多新的耐药形式出现，例如阿德福韦治疗时出现的rtN236V突变[12]，这也要求对耐药检测要更全面。最近关于恩替卡韦耐药的研究发现，拉米夫定耐药病人如果出现rt184、rt202或rt250的突变，均会导致恩替卡韦治疗失败，而且耐药突变呈现累积增加的特点。这些新的问题都会限制以特定位点变异的方法（RFLP, LIPA, RFMP）的应用，而序列测定判断耐药突变则可以解决上述问题，但后者的临床应用面临着法律和操作标准化的问题。鉴于耐药突变类型越来越多、越来越复杂，建议将直接序列测定纳入临床耐药检测范围，在此基础上成立各地区的HBV耐药检测标准实验室，相信会较好地解决临床耐药检测手段滞后于临床治疗的问题。

4.HBV基因型：采用片段重组法可以快捷地分析和判别HBV基因型的类别，以及是否为新的基因型或亚型或新的重组体[13]。对我国主要的HBV基因亚型调查发现，我国仅有Ba亚型，而C型中则主要为C1和C2亚型[14,15]。我们对C/D重组体的地理分布特点、临床特征以及病毒生物学作了进一步的分析，发现在我国西部地区，从甘肃至青海至西藏地区C/D重组体呈阶梯样分布；C/D重组体感染者疾病的自然转归较好[16]。

HBV基因型的分布在HBeAg阴性肝炎患者中的特点与非活动性携带者（inactive carrier）不同：前者C型明显多，后者主要为B型感染，提示基因型对HBV自然史的影响。同时，HBV基因B型和G1896A突变的发生关系密切，而HBV基因C型，主要是C1亚型则和A1762T/G1764A联合突变相关（待发表）。

我们的研究发现，HBV基因C型HBsAg的分泌效率明显较B型低，导致前者血清HBsAg水平低、HBsAg阳性肝细胞（免疫组织化学染色）比例高；血清HBsAg和HBV DNA水平之间的正相关仅存在于HBV基因B型患者，在HBV基因C型患者不明显[17]。临床流行病学调查和体外试验结果支持HBV基因型可能导致病毒生物学特征、慢性感染自然史、疾病转归、干扰素治疗反应等方面的差异；但HBV基因型检测目前仅作为科学研究手段，临床常规应用的时机尚不成熟。


二、病毒抗原检测

1.血清HBsAg定量检测：雅培公司的Architect i2000可以进行HBsAg定量检测，结果以IU/ml表达，检测范围为0.05~250 IU/ml；但绝大部分慢性乙型肝炎患者需要稀释后进行再测定，推荐采用1:500的比例稀释[17]。检测过程全自动化，速度快；但稀释过程为人工操作，费时费力，需要改进。

聚乙二醇干扰素、阿德福韦以及拉米夫定可以在治疗早期（如12周）降低血清HBsAg水平，但总体上血清HBsAg水平在长期治疗过程中呈较典型的双相型变化：治疗早期血清HBsAg快速下降、之后下降不明显（待发表）；在拉米夫定治疗12周时，血清HBsAg水平下降和HBV DNA下降平行，但以HBV基因型分层后，这种平行关系仅见于HBV基因B型患者（待发表）。

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血清HBsAg水平和HBV cccDNA水平正相关，包括治疗之前和治疗后[18-20]；但考虑到血清HBsAg水平在长期治疗（例如3年拉米夫定）后期下降不明显（待发表），并且和HBeAg转阴关系不密切，因此目前尚不推荐将血清HBsAg定量作为抗病毒治疗（尤其是口服抗HBV药物）疗效评价的临床检测项目。血清HBsAg丢失甚至发生血清学转换是抗-HBV治疗的终点，因此建议在抗病毒治疗期间可不定期定性检测HBsAg。

2.HBeAg定量检测：雅培公司曾经提供过HBeAg定量检测服务，但目前没有商品化的HBeAg定量试剂，导致临床广泛应用受限。
HBeAg定量可以在个别实验室进行，但必须要有HBeAg的标准品。HBeAg定量检测可以判断HBV母婴传播的病毒动态变化特征[21]以及可用于预测干扰素治疗效果的评价[22]。也有一些报告采用S/CO指标值作为HBeAg水平的标志，发现拉米夫定治疗可以降低HBeAg、且与HBV DNA下降一致，也可能会起到预测拉米夫定耐药出现的作用[23]。需要加强HBeAg定量的应用研究，以丰富诊断和治疗评价的手段。


总之，关于乙肝病原学诊断方面的进展主要集中在HBV核酸（包括血清HBV DNA，肝内HBV cccDNA以及HBV RNA）以及HBV抗原的定量测定（HBsAg, HBeAg）方面，应用重点是监测和评价抗病毒治疗反应。愿我国肝病工作者深度参与这些拓展性工作，为我国乙肝病原学诊断做出自己的贡献。

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http://www.natap.org/2007/AASLD/AASLD_70.htm