肝衰竭患者血浆(血清)对体外培养肝细胞毒性作用的研究现状

2002落叶

程永波 王英杰

　　生物人工肝是以培养肝细胞为基础的人工肝支持系统，高活性和功能良好的肝细胞是其基本要素之一，然而，由于肝衰竭患者肝脏大量肝细胞坏死，导致机体代谢紊乱和大量毒性物质堆集，这些毒性物质会对反应器中肝细胞产生毒性作用，直接影响生物人工肝的治疗效果。因此，了解肝衰竭患者血浆（liver failure plasma，LFP）或血清（liver failure serum，LFS）对体外培养肝细胞的各种不良作用，对生物人工肝的临床应用有重要意义。本文综述近年来在该领域的研究进展。

　　一、对肝细胞生长和活力的影响

　　正常培养液多采用DMEM、RPMI?1640等加小牛或胎牛血清，与此相比，几乎所有实验都显示肝衰竭患者血浆(血清)或其特定成分对肝细胞生长有抑制作用，这种抑制作用随肝衰竭患者血浆(血清)浓度增加而增强，随肝细胞接种密度减低而减弱，随培养时间延长而加重，多在24 h后观察到形态变化。很早就有学者发现LFS能抑制HepG2细胞生长，接种1×105/cm2比接种1×104/cm2受抑严重，随培养时间延长出现细胞膜不清、胞质簇集小颗粒等变化。胆汁酸成分中牛磺鹅去氧胆酸（TCDC）、甘氨鹅去氧胆酸（GCDC）等在0.5～1 mmol/L浓度时并不导致原代培养大鼠肝细胞活力降低，但在2 mmol/L时出现普遍细胞坏死、脱离、畸形。此类抑制作用多表现于24 h后，LFP作用大鼠肝细胞2～20 h，与正常人血清和常用培养液相比，细胞活力并没有明显变化。抑制机制目前尚不清楚，可能由于LFP抑制钠通道，导致Na?K?ATP酶失活，无能量供应，分子合成能力下降，细胞分裂受抑。LFP中部分成分对肝细胞生长无抑制作用，牛磺胆酸和甘氨胆酸即使在2 mmol/L浓度，细胞接种后仍可在24 h铺展、汇合，无脱离、畸形，5 d中细胞胞质无空泡，与对照组无差异［1］。

　　二、 对肝细胞膜的损伤

　　LFP（LFS）对培养肝细胞膜的损伤主要是使细胞膜通透性增高，表现为51Cr和相关酶的释放增多。Mcloskey等［2］用含Na512CrO4的正常人血浆(NP)、LFP、常用培养液培养HHY41肝细胞16 h，之后全换为常用培养液再培养16 h，LFP组51Cr释放比NP组和对照组高近20倍。Hiromitsu等［1］用LFP成分培养，TCDC组和GCDC组ALT漏出第1天比对照组分别升高13倍和16倍。不少研究显示，LDH漏出也都比对照组显著升高。细胞膜受损原因可能是内毒素、致炎细胞因子、胆汁酸、硫醇类、非结合胆红素、肝细胞内钙过多等所致［2，3］，也可能与氧化应激及免疫反应有关。目前对胆汁酸所起作用研究较多，显示TCDC、GCDC更容易在细胞内积蓄，可与胆固醇和磷脂在细胞膜上形成微胶粒，并在2mmol/L以下浓度即可发生上述变化，而在LFP中，TCDC可达正常人的103倍，GCDC为42倍［1］。还有研究显示，胆盐可致细胞内钙离子浓度升高，细胞膜破裂，紧密连接处通透性改变，膜流动性改变，并且脱氧胆酸更易引起上述变化，如鹅去氧胆酸、TCDC，在高浓度时可导致肝细胞坏死。在肝衰竭患者中胆盐升高可达健康人的数十倍。Pazzi等［4］用气相和液相色谱议分析10例暴发性肝衰竭患者LFS，总胆汁酸达150 μmol/L时，鹅脱氧胆酸占80%。因此，在生物人工肝的临床应用中，这是一个不能忽视的因素。

　　三、抑制大分子合成

　　LFP抑制大分子合成，主要表现为RNA、DNA和蛋白质合成减少，目前研究对象有HepG2、HHY41及来源于大鼠、兔、人再生肝等肝细胞。与10%胎牛血清培养相比，10% LFP培养HepG2细胞4 d，RNA合成减少约55%；因培养细胞、作用时间（16～96 h）及LFP浓度(10%～100%)不同DNA减少由10%至200%不等，蛋白质减少由10%至60%不等。Hiromitsu等［1］认为这种抑制机制可能为LFP中的胆汁酸在细胞内积累，损害细胞内细胞器如线粒体，改变染色质结构，激活核酶，导致转化代谢物直接损伤DNA。也有学者认为LFP中的IL?1、TGF?β对抑制细胞增殖起一定作用，这种观点由后来的学者进一步证实。Nozato等［5］发现肝衰竭患者血中IL?1和TGF?β1都升高，TGF?α降低，肝细胞增殖受抑与上述细胞因子变化有关。Thomas等［6］则进一步认为TGF?β1的增多会引起P21上调，P21是细胞周期调节蛋白激酶抑制因子，通过抑制与G1期有关的细胞周期调节蛋白和蛋白激酶如Cdk2而抑制肝细胞增生。由于上述机制，DNA合成下降，蛋白合成减少。RNA、DNA和蛋白质的这种变化也间接反映了LFP对细胞生长的抑制。

　　四、生物转化和物质代谢

　　肝脏是机体内生物转化中心，把药物、毒物等转变为无毒或毒性小的易于排泄的物质，同时又是重要代谢器官，对体内各类物质的合成、分解、转化等起重要作用。生物人工肝即以发挥此类作用为主要目的，但研究显示LFP对肝细胞的上述功能也有抑制作用。Mcloskey等［2］用HHY41细胞与100%浓度LFP作用16 h后，换含2 mmol/L咖啡因的无血清培养液培养48 h，测定咖啡因代谢产物，LFP组测得的胆茶碱、可可碱、二甲基黄嘌呤值分别是对照组的1/6、1/20和1/40。通常用睾酮来评价类固醇代谢，睾酮降解需要7α? 羟化酶、6β?羟化酶、16α?羟化酶和5α?还原酶，因此测定细胞中上述四种酶的含量可反映睾酮的代谢情况，从而间接了解类固醇代谢。同样采用HHY41细胞与100%浓度LFP作用16 h，换含睾酮底物的无血清培养液培养1 h，LFP组中6β?羟化酶、16α?羟化酶、5α?还原酶分别是对照组的1/4、1/7、1/10，7α?羟化酶两组差异无显著性。在物质代谢方面，Hiromitsu等［1］研究了尿素合成和糖异生，用含胆汁成分的培养液培养大鼠肝细胞5 d，分别在第1、3、5天加入5 mmol/L NH4Cl溶液和1 ml含2 mmol/L丙氨酸、2 mmol/L α?羟基丙酸、10-7 mol/L高血糖素的糖异生底物溶液，第1天各组尿素合成都比对照组低，TCDC组低近100倍；糖异生底物溶液与细胞作用90 min后葡萄糖值各胆汁培养组也都低于对照组，GCDC组和TCDC组低近200倍，二者都严重干扰肝细胞糖异生功能。第3、5天尿素和葡萄糖合成持续减低。Hiromitsu等［1］认为这种减低的原因可能为随着细胞膜的损伤，细胞器的尿素循环和糖异生途径被阻断。细胞因子也可抑制尿素合成，Kang等［7］用IL?1和IL?6体外干预大鼠肝细胞，尿素合成量干预组比对照组少40%～50%。

　　五、LFP与凋亡

　　肝衰竭时可引起肝细胞凋亡，诱导因素有各种细胞因子、HBV、HCV、乙醇、血浆中升高的胆酸和药物性肝衰竭中的对乙酰氨基酚等［8?10］，由于LFP毒性成分复杂，在体外培养肝细胞凋亡研究中，多只采用致凋亡明显的胆酸做干预。人体内胆酸约有15种，近10种在LFS中有显著升高，可引起凋亡。各种胆酸中，以去氧胆酸致凋亡作用大，鹅去氧胆酸浓度为130 μmol/L时，4 h可诱导60%细胞凋亡［4］。暴露于甘氨鹅脱氧胆酸2 h，可导致12.5%左右的鼠肝细胞凋亡［11］。用肝移植切下肝组织来源肝细胞，50 μmol/L GCDC作用4 h，肝细胞出现皱缩，核染色质浓缩和边集，与对照组相比，DNA裂解增加1～1.6倍，而在100 μmol/L浓度下作用4 h则引起细胞死亡［12］。不同的胆汁酸致肝细胞凋亡机制不同［13］：HepG2细胞通过激活Fas系统诱导凋亡，肝组织来源肝细胞Fas受体并不增加，提示与Fas系统无关，而大鼠肝细胞则通过激活蛋白激酶C和半胱氨酸蛋白酶而产生凋亡，其他因素如氧自由基也有助于凋亡发生。另外，肝毒素引起的肝细胞凋亡与钙离子流有一定的关系；乙醇和对乙酰氨基酚协同作用也可导致肝细胞凋亡，并且这种凋亡与线粒体损伤有关。LFP胆酸以外的成分中，非结合胆红素能引起神经细胞凋亡，其对肝细胞作用尚少见报道。

　　六、LFP对肝细胞解毒作用的影响

　　由于肝细胞功能丧失，肝衰竭患者体内大量毒性物质积聚，因此生物人工肝的解毒作用尤其重要，抗氧化和混合功能氧化酶（MFO）系统是肝细胞中两条主要的解毒途径。前者主要有抗氧化剂和抗氧化酶，如谷胱甘肽（GSH）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH?Px）、谷胱甘肽转硫酶（GST）等，后者主要是细胞色素P450家族。

　　GSH主要解除亲电子外源性化学物质和内源性复合物及它们代谢产物的毒性，如过氧化氢、有机过氧化物、自由基，其细胞内的含量通常会反映潜在毒性物质的命运，检查GSH状态可揭示毒性代谢的信息。众多研究显示，LFP或其成分干预的细胞内GSH变化并不规律，有升高也有降低，与LFP浓度、培养时间、细胞种类等有关。早期学者用10%LFP作用于HepG2细胞，25 h后细胞内GSH含量比对照组显著升高，但4 d后骤降在对照组以下。而Mcloskey等［2］报道100%LFP培养HHY41永生化细胞16 h，GSH和GSSG较单纯培养液都下降。对于GSH的上述变化有各种解释。有学者推测，肝细胞与LFS直接接触可激活细胞防御系统和诱发适应性反应，提高GSH，因此认为GSH含量的升高是一种保护性反应，这种现象在细胞对数生长期和长满瓶壁时都能观察到。而Mcloskey等［2］认为GSH和GSSG下降，原因可能是LFP中较多的介质与GSH结合导致细胞内GSH消耗。另外GSH也能直接与氧自由基反应，导致其消耗。GSSG是随GSH减少而减少的。细胞色素P450是肝脏解毒的另一途径，正常血浆中的特定分子能诱导P450生成，但LFP对其生成有抑制作用。Mcloskey等［2］用依赖7－乙氧基－试卤灵的去乙氧基酶(EROD)和依赖7－甲氧基－试卤灵的去甲氧基酶(MROD)活性来评价P450含量，LFP作用HHY41肝细胞16 h，EROD和MROD比正常血浆培养组低0.5～4倍不等。早期也有报道，经LFP培养细胞P450含量升高，肝细胞解毒功能增强。

　　七、LFP对肝细胞影响的其他观点

　　（一）生长因子细胞的增生受各种各样的生长因子和细胞因子控制，猪部分肝切除后，再生肝制得的HGF能刺激体外原代培养肝细胞增殖，但高浓度HGF对体外培养肝细胞增殖却起抑制作用［14］，LFP中大多含有较高浓度的HGF，此是否为肝细胞生长受抑的原因尚不清楚。

　　（二）免疫异源性免疫反应对肝细胞有较严重的损伤，采用猪肝细胞做灌流研究，60 h后细胞球形体几乎完全崩解［15］，可能与LFP中抗体和补体有关。Jo2抗鼠CD95单克隆抗体可导致小鼠肝细胞死亡［16］。另外，正常人血清对体外培养细胞的效果不佳，其培养肝细胞的代谢能力甚至不如合成培养液，这也可能与异源性补体和抗体有关。

　　（三）其他毒性物质正常人血浆中的内毒素水平一般在3 pg/ml左右，肝炎患者明显增高，甲型肝炎患者平均内毒素浓度为54.71 pg/ml，重型肝炎患者内毒素血症更严重，发生率高达92.8%。内毒素在体内可损害肝细胞结构和功能，在体外对肝细胞也有很大损伤。此外，从死亡细胞释放的水解酶如钙蛋白酶、糖基化终端产物以及治疗肝性脑病患者所用的甘油等，都可抑制肝细胞生长，破坏肝细胞功能［17］，甘油对HepG2细胞的生长抑制尤其严重。

　　八、LFP（LFS）毒性作用的防治

　　迄今为止，虽有报道LFP能加强生物反应器中肝细胞功能，对其活力无影响，但大部分学者认为，LFP和LFS对体外培养的肝细胞有毒性作用，并在减轻LFP和LFS毒性方面做了不少有益的研究。

　　Benoist等［18］在生物反应器中加入蛋白酶抑制剂，发现细胞活力比无蛋白酶抑制剂组高20%，经60 h灌流后细胞球形体仍有部分保持完好，而无蛋白酶抑制剂组细胞几乎完全崩解，原因可能为蛋白酶抑制剂能减少异源性免疫反应。另外，对肝细胞作合适的处理也可减轻LFP的毒性破坏，如用AN69聚合物包裹，在三维空间反应器中加入另外的基质进行复合培养等，这些措施对反应器中的肝细胞有保护作用，并能增强肝细胞功能［18］。

　　此外，有学者用加热、透析、活性炭柱吸附等方法预处理LFP（LFS），发现都可减少LFP（LFS）毒性，用活性炭柱进行LFP（LFS）灌流，毒性物质降低显著，降低幅度与持续时间和次数有关。但也有学者报道活性炭柱作用有限，灌流前后胆汁酸并无变化，并且同时会除去一些有益因子，因此认为此方法并不令人满意［19］。在其他吸附研究中，有学者用Lixelle（一种选择性β微球蛋白吸附剂）在体外测定其对细胞因子的吸附率，IL?1、IL?6、IL?8和TNF?α分别为98.5%、82.9%、99.9%、31.2%，这或许可用于LFP（LFS）的预处理。

　　九、展望

　　现代生物人工肝是人工肝发展的趋势，其核心生物材料是肝细胞，肝细胞功能的好坏直接影响到临床治疗效果，因此LFP（LFS）的上述毒性作用不能被忽略，但在此领域的研究中多采用药物性肝衰竭患者的LFP或LFS，其他原因引起的肝损伤患者血浆或血清对肝细胞影响并不十分清楚，这是今后需要进一步研究的方向。

2002落叶

参考文献

　　1、Hiromitsu N, Michiaki M, Makoto N, et al. Injuriousness of glycochenodeoxycholate and taurochenodeoxycholate to cultured hepatocytes. J Artif Organs, 2002,5∶30?36.

　　2、Mcloskey P, Tootle R, Selden C, et al. Modulation of hepatocyte function in an immortalized human hepatocyte cell line following exposure to liver?failure plasma. Artif Organs, 2002,26∶340?348.

　　3、Donald OJ, Lorella P, Dora B, et al. Molecular basis of bilirubin?induced neurotoxicity. Trends Mol Med, 2004,10∶65?70.

　　4、Pazzi P, Morsian E, Vilet A, et al. Serum bile acids in patients with liver failure supported with a bioartificial liver. Pharmacol Ther, 2002,16∶1547?1554.

　　5、Nozato E, Shiraishi M, Nishimaki T.Up?regulation of hepatocyte growth factor caused by an over?expression of transforming growth factor in the rat model of fulminant hepatic failure. J Surg Res, 2003, 115∶226?234.

　　6、Thomas T, Mizuguchi T, Sugiyama N, et al. Immediate early genes and p21 regulation in liver of rats with acute hepatic failure. Am J Surg, 2002, 183∶457?463.

　　7、Kang H, Berthiaume F, Yarmush M. Long?term stable cultures of rat hepatocytes∶ an in vitro model to study acute and chronic hepatic inflammation. Tissue Eng, 2002, 8∶681?693.

　　8、Marieke H, Schoemaker P, Jenny E, et al. Cytokine regulation of pro? and anti?apoptotic genes in rat hepatocytes∶ NF?B?regulated inhibitor of apoptosis protein 2 (cIAP2) prevents apoptosis. J Hepatol, 2002,36∶742?750.

　　9、Higuchi H, Bronk S, Takikawa Y, et al. The bile acid glycochenodeoxycholate induces trail receptor 2/DR5 expression and apoptosis. J Biol Chem, 2001,276∶38610?38618.

　　10、Neuman MG. Synergetic signaling for apoptosis in vitro by ethanol and acetaminophen. Alcohol, 2002,27∶89?98.

　　11、Webster CR, Anwer MS. Phosphoinositide 3?kinase, but not mitogen?activated protein kinase, pathway is involved in hepatocyte growth factor?mediated protection against bile acid?induced apoptosis in cultured rat hepatocytes. Hepatology, 2001,33∶608?615.

　　12、Benz C, Angermüller S, Otto G, et al. Effect of tauroursodeoxycholic acid on bile acid?induced apoptosis in primary human hepatocytes. Eur J Clin Invest, 2000,30∶203?209.

　　13、Rui FM, Silva CJ. Bilirubin?induced apoptosis in cultured rat neural cells is aggravated by chenodeoxycholic acid but prevented by ursodeoxycholic acid. J Hepatol, 2001,34∶402?408.

　　14、李菁, 戚晓红, 李跃华, 等. 猪再生肝肝细胞生长因子治疗急性肝衰竭大鼠的实验研究. 中国生化药物杂志, 2002,23∶23?25.

　　15、Yamashita Y, Shimada M, Tsujita E, et al. The efficacy of nafamostat mesilate on the performance of a hybrid?artificial liver using a polyurethane foam porcine hepatocyte spheroid culture system in human plasma. Int J Artif Organs, 2001,24∶34?40.

　　16、Jodo S, Kung J, Xiao S. Anti?CD95?induced lethality requires radioresistant Fc gamma RII+ cells. A novel mechanism for fulminant hepatic failure. J Biol Chem,2003,278∶7553?7557.

　　17、Limaye PB, Apte UM, Shankar K. Calpain released from dying hepatocytes mediates progression of acute liver injury induced by model hepatotoxicants. Toxicol Appl Pharmacol, 2003,191∶211?226.

　　18、Benoist S, Sarkis R, Barbu V. Survival and functions of encapsulated porcine hepatocytes after allotransplantation or xenotransplantation without immunosuppression. Surgery, 2001,129∶606?616.

　　19、Ryan CJ, Anilkumar T, Ben?Hamida AJ, et al. Multisorbent plasma perfusion in fulminant hepatic failure： effects of duration and frequency of treatment in rats with grade III hepatic coma. Artif Organs, 2001,25∶109?118.

　　《肝脏》版权