乙型肝炎防治研究－基因治疗 供稿人：陈大明 审校人：吕静 供稿时间：2006-3-2www.istis.sh.cn/hykjqb/wenzhang/list_n.asp?id=1343&sid=2 基因疗法是指采用一定的技术和手段, 将目的基因或小干扰RNA导入体内以纠正基因结构和功能异常的一种治疗疾病的方法。乙型肝炎的基因治疗研究虽然取得了一系列的进展，但由于病毒性肝炎的发病机制还没有完全了解清楚，目前基因治疗在病毒性肝炎治疗中的应用远未达到理想水平。 病毒性肝炎的基因治疗一方面取决于基因治疗技术本身发展的速度和状态，另一方面也取决于病毒性肝炎发病机制本身研究的深入程度。目前，慢乙肝基因治疗的研究，基因疫苗将是率先用于临床治疗的一种基因治疗手段。可能的基因治疗手段包括基因疫苗、反义核苷酸、核酶和RNA干扰等。尽管目前基因治疗离临床应用还有较大距离，但由于分子生物学技术的迅速发展，基因治疗将在抗HBV治疗中发挥关键作用。 1乙型肝炎的RNA干扰治疗 RNA干扰（RNA interference，RNAi）现象广泛存在于生物界，从低等的原核生物到人类均已有发现。将与靶基因的转录产物mRNA对应的正义RNA和反义RNA组成的双链RNA（double stranded RNA，dsRNA）导入细胞，可以使该mRNA降解，导致靶基因沉默。这种转录后基因沉默机制（post-transcriptional gene silencing，PTGS）被称为RNA干扰。 近年来对RNA干扰(RNA i) 的研究进展迅速, 用一定的方法将小干扰RNA ( siRNA ) 导入细胞, 可特异性地抑制各种外源性和内源性的致病基因, 从而达到治疗疾病的目的。随着对RNA 干扰现象认识的深入,现在已经在病毒感染、肿瘤和遗传性疾病中取得了良好的效果。国外研究发现针对HBV 基因组的序列特异性的X2siRNA 的表达载体与HBV2DNA 共转染细胞后，HBsAg 降低60 %；用siRNA 转染能表达HBV2特异性转录物的鼠模型,使鼠模型中HBsAg 和或可能出现的HBeAg明显下降。 siRNA要应用于临床，目前需要明确最有效的靶位将siRNA 高效导入靶位的方法、siRNA 在体内的代谢规律以及安全性等问题。 2 乙型肝炎的反义治疗 反义技术是依赖反义寡核苷酸(ODN) 、核酶等手段进行基因治疗、基因调控研究的技术，它能在基因水平上考虑如何选择性地关闭或修饰任何一个特定基因，使其丧失活性而达到对疾病的特异性治疗，或研究特定基因的功能及基因的调控机制。反义寡核苷酸主要是设计针对HBV基因组不同编码区互补的ODN或反义RNA，并与之互补结合抑制其表达而达到抑制HBV的目的。这些反义ODN 在细胞水平上都能抑制HBV特定基因的表达。但ODN较差的跨膜能力，非特异性导向以及细胞内的低稳定性等问题限制了其进一步的应用与发展。 核酶裂解物RNA高度特异性，高效裂解RNA底物的性质，作为抗病毒基因治疗的新型分子，受到了广泛的重视。核酶是具有RNA 裂解活性的RNA 分子,探讨利用核酶作为HBV 的反义抑制手段一直是研究的热点。锤头状核酶的发现较早,而且应用灵活,所以它在针对HBV 感染的基因治疗方面的应用研究较多。然而,锤头状核酶在天然状态下是在植物细胞中发挥活性的。其与人体细胞的相容性、在细胞内的活性、维持时间的问题都使其很难在HBV 感染的基因治疗方面找到接近临床的治疗途径。虽然HDV核酶作为HBV 的反义抑制剂有其独特的优势，但要使HDV 核酶应用于临床治疗,仍存在许多问题。这些问题主要为如何筛选高效的靶位点及HDV 核酶突变体,如何构建高效、安全且具有靶向性的转移载体，携带HDV 核酶进入靶细胞内发挥作用。 随着核酶和病毒载体的进一步深入研究，HDV核酶一定能成为治疗乙型肝炎的特异、高效的反义药物。 3乙型肝炎病毒DNA 疫苗 乙型肝炎病毒(HBV)DNA 疫苗是指通过克隆HBV抗原基因，并将其插入真核表达载体构建而成的重组DNA 分子，由于其稳定性、构建的方便性、无血源播散疾病的危险性以及可动态跟踪病毒的变异等诸多优点，使其发展前景乐观。乙肝DNA疫苗不仅能引起宿主的体液免疫，还能产生细胞免疫，这是由于它模拟了病毒的自然感染过程.DNA质粒在注射部位被肌细胞摄取后，通过所含的启动子和增强子系统调节合成的所编码的蛋白质.被细胞内蛋白酶复合体降解成含病毒表面抗原的肽段，进人内质网与合成的MHCI类分子结合,然后被转运系统递呈到细胞膜表面。部分被分泌或释放人血的蛋白质,激活特异性B细胞,从而产生保护性抗体。 国外的研究表明, 预防性HBV DNA疫苗可诱导快速的加强免疫反应，但可能由于接种时质粒量、压力、基因枪系统等原因，最终的免疫效果不尽人意，要将其应用于临床，还需进一步研究。我国学者选用HBV包膜蛋白和核心蛋白抗原基因,联合细胞因子人IL212 基因，成功构建新型乙型肝炎DNA 疫苗，用减毒沙门菌为载体进行口服接种，以小鼠和恒河猴为动物模型验证,证明该疫苗能高效免疫，尤其是能诱导强细胞毒性T淋巴细胞反应和T细胞分泌IFN2γ、TNF 等细胞因子，具有预防和治疗乙型肝炎的双重作用。国外有研究在动物模型研究证明治疗性HBV DNA 疫苗有切实效果的基础上，进行了HBV DNA 疫苗的人体试验。试验表明HBV 疫苗的确能抑制HBV 复制，但效果有限，应考虑采用不同的免疫接种方案以提高治疗效果。此外，还有初步研究提示用于临床实验的DNA 疫苗对人体是安全的。但DNA 疫苗与其他已广泛应用的疫苗相比,尚缺乏经过周密设计的大规模远期对照研究,在增强免疫效果、与人体内各种分子的相容性、与同时免疫的其他疫苗的相容性、遗传学稳定性及安全性等方面还有待进一步研究。 HBV DNA 疫苗要真正可靠地应用于临床，还需要在以下方面进行深入研究：(1) 提高细胞转染的特异性和高效性；(2)提高安全性,减少可能对人体造成的危害,如质粒DNA 分子整合到宿主染色体上致畸或激活原癌基因而致癌、引起免疫耐受和自身免疫性疾病等；(3)减少由于DNA疫苗免疫可导致机体对其他免疫的抑制或无反应的可能；(4)提高机体对DNA 疫苗的反应性，尽可能减少无应答和弱应答反应，以提高基因免疫和保护范围和免疫效果。 参考文献 1 Thermet A , Christine R , Zoulim F, et al. Progress in DNA vaccine for prophylaxis and therapy of hepatitis B. Vaccine , 2003 , 21 : 659-662. 2 Prince AM , Whalen R , Brotman B, et al. Successful nucleic acid based immunication of newborn chimpanzees against hepatitis B virus. Vaccine, 1997,15 :916. 3 Tacket CO , Roy MJ , Widera G. Phage 1 safety and immune respons estudies of a DNA vaccine encoding hepatitis B surface antigen delivered by a gene delivery device. Vaccine, 1999, 17: 2826-2829 4 SHLOMAI A , SHAUL Y. Inhibition of hepatitis B virus expression and replication by RNA interference. Hepatology, 2003, 37 (4) :7642770. 5 Michael ML , Goldbeck C , Pertile T, et al. Immunotherapy of chronic hepatitis B by anti2HBV vaccine : from present to future. Vaccine, 2001, 19: 2395-2399. 7 Swain WE , Heydenburg-Fuller D, Wu MS, et al. Tolerability and immune responses in humans to a PowderJect DNA vaccine for hepatitis B. Dev Biol (Basel) ,2000 ,104 :115-119. 8 Haworth R , Pilling AM. The PCR assay in the preclinical safety evaluation of nucleic acid medicines. Hum Exp Toxicol, 2000, 19 :267-276. 以上内容仅供参考．
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发表于 2007-2-11 23:00
