人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则

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 http://www.sfda.gov.cn/cmsweb/webportal/W4278/A25922666.html

一、序言
    体细胞治疗是指应用人的自体、同种异体或异种（非人体）的体细胞，经体外操作后回输（或植入）人体的治疗方法。这种体外操作包括细胞在体外的传代、扩增、筛选以及药物或其他能改变细胞生物学行为的处理。经过体外操作后的体细胞可用于疾病的治疗，也可用于疾病的诊断或预防。体细胞治疗具有多种不同的类型，包括体内回输体外激活的单个核白细胞如淋巴因子激活的杀伤细胞（LAK）、肿瘤浸润性淋巴细胞（TIL）、单核细胞、巨噬细胞或体外致敏的杀伤细胞（IVS）等等；体内移植体外加工过的骨髓细胞或造血干细胞；体内接种体外处理过的肿瘤细胞（瘤苗）；体内植入经体外操作过的细胞群如肝细胞、肌细胞、胰岛细胞、软骨细胞等等。

    由于体细胞治疗的最终制品不是某一种单一物质而是一类具有生物学效应的细胞，其制备技术和应用方案具有多样性、复杂性和特殊性，因此不能象一般生物制品那样制订出适合于每一种方案的具体标准，本指导原则只提出一个共同的原则，具体的申报资料和应用方案应根据本技术指导原则加以准备、申请和实施。对每个方案的整个操作过程和最终制品必须制定并严格执行（实施）标准操作程序，以确保体细胞治疗的安全、有效。

    二、申报资料
    （一）体细胞治疗制剂的名称、选题目的与依据、国内外研究现状或生产使用情况
    1．申请表
    2．体细胞治疗制剂的名称及命名依据
    3．选题的目的和立题依据
    4．国内外有关该制剂的研究现状、生产及临床应用情况（包括专利查询情况）
    5．临床应用的风险性评估

    （二）体细胞的采集、分离和检定
    1．体细胞类型和供体的情况
    （1）体细胞类型
    须指出细胞来源是属于自体、同种异体、异种还是细胞系。必须提供细胞的组织来源及细胞类别的确证资料，其中包括形态生化或表面标志等。

    （2）供体
    若体细胞来源于同种异体，需说明供体的年龄、性别，供体必须符合国家对献血员的要求，并提供测试的方法及符合条件的依据。供体必须经过检验证明HBV抗原、抗HCV、抗HIV-1/2、梅毒抗体、细菌、霉菌均为阴性，必要时需说明供体的既往病史、家族史等临床资料。对于那些需通过激活体内免疫功能发挥作用或需体细胞在体内长期存活的体细胞治疗项目，除ABO血型外，还必须对供体做HLA-I类和II类分型检查，并证明与受体（病人）相匹配，同时提供检测方法和依据。
    若体细胞来源于动物，必须提供动物的来源，遗传背景，健康证明（如重要病原体，包括人畜共患疾病的病原体），饲养条件，应用此类体细胞的必要性和安全性。

    （3）细胞系
    若采用细胞系进行体细胞治疗，应按国家相关规定进行主细胞库、种子细胞库及生产细胞库三级细胞库的建立及管理。应详细记述细胞的来源、鉴别标志、保存、预计使用寿命，在保存和复苏条件下稳定性的依据。生产细胞库不应含有可能的致癌因子，不应含有感染性外源因子，如细菌、霉菌、支原体及病毒。

    2．体细胞的采集
    应对采集体细胞的技术方法的安全性、可行性、稳定性进行充分论证，应提供体细胞采集技术的标准操作程序，应说明采集体细胞的地址/环境，所用的设备和设施、保存和运输的环节和条件，预防微生物及病毒等有害因子污染的方法，预防共用设备和设施可能带来的交叉污染等措施。

    3．体细胞的分离
    应详细规定分离体细胞用的方法、材料及设备，应提供在此过程中所用的各种材料的资料，如果是购买的原材料，应有供应商/制造商提供的产品说明及分析合格证明。
当应用单克隆抗体进行有关操作时，应参照国家药品管理当局有关规定进行。

    4．体细胞的检定
    在体细胞采集及分离过程中的适当阶段，应对体细胞进行质控检定，包括采集与分离体细胞的收率、存活率、纯度、均一性等。应详细说明检定体细胞所用的方法、材料及设备，并制定合格标准。

    （三）体细胞的体外操作
    1．培养基
    （1）所有成分应有足够纯度（例如水应符合注射用水标准），残留的培养基或受者不应有明显影响。每个培养细胞的部门应保证所用的各种成分的质量都经过鉴定，并制定标准规格。若用商业来源的培养基，应由厂商提供全部培养基成分资料。

    （2）血清的使用
    除能证明体细胞培养或激活需要血清外，应避免使用任何血清。不得使用同种异体人血清或血浆。如必须使用动物血清，应考虑每批血清都应对潜在的外源因子（包括人的病原体）进行检查、筛选。例如，牛血清应进行病毒和支原体污染的检查筛选等。

    （3）人血液成份的应用
    若培养基中含有人的血液成份，如白蛋白及转铁蛋白，应说明其来源、批号、质量检定合格报告，应尽可能用已批准上市的产品。

    （4）条件培养基的应用
    在体细胞培养中使用细胞培养来源的条件培养基时，有可能增加了制剂的危险性及降低产品的一致性。因此，尽可能确定条件培养基的必要成份，以及尝试用确定的试剂取代条件培养基。在应用条件培养基时应考虑以下几点：
    ①应详细提供条件培养基的来源、加工及使用说明。
    ②当用供者（人）细胞制备条件培养基时，应对供者按献血员标准进行传染因子的检查。
    ③当用自体细胞制备条件培养基时，应减少传播病毒性疾病的危险，病毒在体外扩增的能力亦应考虑。

    （5）抗生素的应用
    培养基中尽量避免使用内酰胺类抗生素。若采用青霉素类抗生素，应做青霉素皮试，该细胞制剂应标明加用的抗生素，并不得用于已知对该药过敏的患者。另外，应做不加抗生素的培养对照，以证明能够保持无菌。

    （6）其他成份
    应充分说明体细胞培养和激活时所采用的有丝分裂原、抗体、细胞因子、化学物质，以及培养物。应尽可能采用国家批准临床应用的产品。如上述成份的生产厂家已获国家批准临床应用，可以引用该批件。如上述成份的生产厂家未获国家批准临床应用，应参照国家对相应产品的质控要点，提供质量标准，并对每批产品提供详尽的质量检定报告。

    （7）培养基的检定
    对每批制成的培养基（例如已加入血清及生长添加物等）应进行无菌试验，以及对拟给病人用的体外培养细胞的激活及/或支持生长试验。

    2．生产过程
    生产部门对制备工艺流程应有详细的标准操作程序和适时修订的程序。收获时应保留细胞及培养基样品，供检定用。若细胞培养技术有改进，则应评估对细胞得率、生物学效应、均一性及纯度的影响。
    应叙述保证细胞批同一性和防止交叉污染的质量控制系统，以及适用于长期培养时定期进行的和在体外培养后输注前对所有培养物进行的质量控制系统。

    3．质量控制
    应对所有成份分离、培养及最后处理细胞所用的器具进行质量控制。各种成份都应进行同一性及污染物检查。有生物活性的成份还应进行功能检定。批记录应予保存，该记录应反映制备每批体细胞的所有步骤，记载每一成份的批号及所有检定结果。

    （四）体细胞制剂的检定与质量控制
    各批体细胞的检定包括为验证操作过程对最初数批体细胞所进行的检定及在操作过程做任何改变后进行的检定，以及确定安全性和生物学效应等对每批体细胞所进行的检定，应依据实施方案制定合格标准。
    1．每批体细胞的检定
    （1）得率及存活率：于回输前应进行体细胞得率及存活率检定。
    （2）每批细胞来源的确认：应注明供者的来源并加以标记或确定批号。
    （3）无菌试验：每批培养的体细胞在患者输注前均应进行无菌试验。建议在培养开始后3～4天起每间隔一定时间取培养液样品，包括患者回输前24小时取样，按现行版《中国药典》生物制品无菌试验规程进行。在患者使用前，取培养液及/或沉淀物用丫啶橙染色或革兰染色，追加一次污染检测。

    进行长期培养的体细胞，应进行支原体检查。对大多数自体体细胞产品而言，有效期很短，因此有些试验（如支原体检测）可能对制品的应用来说耗时太长，但每批制品的留样检测是必需的，其结果可以为制品的质量控制提供完整资料。虽然单个病人应用的体细胞不会等到检测完成后再回输，但是如果留样发现阳性结果或发现几次阳性结果后，应及时对生产过程进行检查。如果在体细胞制备的早期发现有污染的情况，应终止该批体细胞制品的继续制备。如果某些检测结果在制品应用时还无结果，应说明可获得结果的时间。

    （4）体细胞的纯度与均一性
    在体细胞回输前，应证明其纯度和均一性已达到可应用水平。
对于经过数代培养的体细胞应进行细胞的鉴定及无污染检查，以保证未被其他类型细胞污染或取代。
    对于体细胞体外操作中所用的非人用成份应测定其成品中的含量，并制定相应的限量指标。

    （5）生物学效应
    如有可能，应尽量检测每批体细胞的生物学效应，例如体细胞具有的某种生物学功能，分泌某种产物的能力，表达某种标志的水平等。

    2．体细胞制剂的检定（申报临床前完成）
    检定项目：
    （1）体细胞制品的得率和存活率：
    （2）体细胞制品的纯度和均一性或特征性表面标志：
    （3）体细胞制品的生物学效应；
    （4）体细胞制品外源因子的检测包括：
    ·细菌
    ·真菌
    ·支原体
    ·病毒
    ·内毒素
    （5）体细胞制品其他添加成份残余量的检测（如牛血清蛋白、抗体、血清、抗生素、固相微粒等）。

    3．体细胞制剂的制造及检定过程，及原始记录和中国药品生物制品检定所的复核检定报告。

    4．体细胞制剂的稳定性
    根据稳定性的实验结果确定有效期，说明体细胞制剂的保存条件、保存液的成份与配方。如果体细胞在处理之前、处理当中或处理之后需由一地运到另一地，应说明运输条件对保存体细胞存活率和功能的影响，应确保运输过程中体细胞制品达至上述检定标准。应提供运输容器能适用运输材料的合格证明。若体细胞制品经冻存后继续用于病人。应在冻融或再扩增后进行上述检定，达到检定标准。

    （五）体细胞治疗的临床前试验
    1．安全性评价
    （1）生长因子依赖性细胞，对其生长行为必须予以监测，若某细胞株在传代过程中失去对该生长因子的依赖，不能再予以使用。

    （2）对同种异体细胞的移植，必须从免疫学方面提供其安全性依据。

    （3）对异种细胞，必须提供该异种细胞在体内存活的时间及安全性的依据。

    （4）毒性试验
    尽可能模拟临床回输方式，高于临床用量的相同组织类型的动物体细胞制品回输入动物体内，观察其毒性反应、过敏反应、局部刺激反应。对特殊来源的体细胞，按具体情况制定毒性反应的评价方法。

    （5）致癌试验
    对于某些长期培养的体细胞，应进行致癌性试验。
    ①体外试验：软琼脂克隆形成试验
    ②体内试验：采用裸鼠试验，按国家药品管理当局有关细胞株检定和质量控制要求进行，应证明经体外处理后已失去生长和增殖能力。

    （6）对于体细胞终制品所用的附加物，应视为体细胞制品的一部分，应做动物毒性试验。

    2．有效性评价
    （1）体细胞的表型
应提供该类体细胞的形态学、表面标志等，该体细胞应具有预期的功能如分泌某种产物（或因子），可通过体外试验加以检测。

    （2）体外试验
    检测体细胞制品的生物学效应如细胞毒效应、免疫诱导/增强或抑制效应、造血细胞增殖能力等。

    （3）体内试验
    如果有可能以动物模型来进行，临床前试验应测定体细胞制品在体内生物学功能及其治疗效果。
    若某种体细胞治疗方法，因种属特异性等原因无法用动物模型体内试验来证实其有效性，应做特别说明，并提供和引证有效性的其它依据。

    （六）体细胞治疗临床试验方案
    1．临床试验方案除参照国家有关临床研究的规定外，必须包括所选用的病种、病人的年龄范围、性别、疾病的发展阶段（临床分期）、试用的病例数、事前制定病例选择与淘汰的标准。

    2．给药的方式、剂量、时间及疗程。如果通过特殊的手术条件导入治疗制品，必须提供详细的操作过程。

    3．评估疗效的客观标准，包括临床指和实验室检测项目。

    4．评估毒副作用及其程度的标准及终止治疗的标准、以及监控毒副作用必须的临床与实验室检测的项目。

    （七）研制及试用单位及负责人资格认证
    提供研究与临床单位的全部主要研究人员和临床工作人员（包括负责医师、护士和实验室操作人员）的工作简历及从事与实施该项体细胞治疗方案有关的经验。提供研究单位从事符合GMP生产临床制品的条件和证明以及临床单位实施该方案的医疗条件。

    （八）体细胞治疗伦理学考虑
    详细要求参见国家药品监督管理局颁发的GCP有关规定。

CIK细胞输注治疗编码为:310800024  血细胞分离单采编码:310800005

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1.西安医学院附属医院生物技术诊断与治疗研究所(DC)

www.xyfy.com.cn www.sctdc.com

2.广州普邦生物免疫技术研究中心(DC)

www.pbbio.com www.pbbiocenter.com

3.中国人民解放军第三○二医院全军病毒性肝炎和艾滋病防治重点实验室生物治疗研究中心(CIK)

www.302hospital.com www.biotherapy.com.cn

4.南方医院生物治疗中心(第一军医大学重点实验室"即南方医科大学临床生物技术研究室")HCC-DC TIL CIK/CTL+IL-2

www.nfyy.com www.nfhoc.com/aboutus1.asp

5.解放军昆明总医院临床实验科(CIK)

www.kmzyy.com/web/K_index.asp?id=42

6.武汉协和医院干细胞中心(DC-CIK)

http://www.whuh.com/tszk/Class2.asp?go=tszk&ClassID=61

7.重庆医科大学附属第二医院.重庆市肝病治疗研究中心

http://www.cqumssah.com.cn/ylzx1.asp?id=24

http://www.hbver.com/Article/yljz/cxlf/200305/1593.html 

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自体CIK治疗的“出生”过程：1991年，美国斯坦福大学医学中心骨髓移植
研究实验室的Schmidt-WolfIGH等人报告，采用抗CD3单克隆抗体(MabCD3)、白细
胞介素2(IL2)、干扰素等培养正常人外周血淋巴细胞后，细胞总的抗肿瘤活性明
显比既往常用的免疫细胞LAK、CD3AK增加，称为细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK
），CIK的培养方法明显比肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）细胞简便。1992年国内开始
CIK的体外及动物实验；1999年国家食品药品监督管理局（SFDA）批准将自体CIK
用于治疗急性白血病及慢性丙肝；2000年以后，我国正式在临床中进行自体DC-CIK
治疗。
　　自体CIK治疗是一种新型的过继性免疫细胞治疗，具有其它过继性免疫细胞
治疗的优点，而且可在较短时间内获得大量的抗自体肿瘤或病毒的免疫效应细胞，
因而临床应用前景好。
http://www.cnpharm.com/www/yyb/yyb_view.jsp?pp_id=47717

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	ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志           2005年12月15日;13(20):2778-2782 过继免疫疗法在慢性乙型肝炎治疗上的应用 　 高新生, 林菊生
	高新生, 林菊生, 华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所 湖北省武汉市 430030 通讯作者: 林菊生, 430022, 湖北省武汉市, 华中科技大学同济医学院附属同济医院肝病研究所. [email protected] 电话: 027-83662578 收稿日期: 2005-10-25     接受日期: 2005-10-31 摘要 国内外的研究都表明, 宿主对HBV各种抗原产生不同程度的免疫耐受, 目前治疗乙肝的药物疗效均有限. 过继免疫疗法因其有希望从源头上解决免疫耐受的问题, 故在慢性乙肝治疗上有很好的应用前景. 我们就过继免疫在乙肝治疗中的研究及其临床应用前景进行了回顾和展望. 关键词: 过继免疫; 骨髓移植; 树突状细胞; 疗法; 慢性乙型肝炎 高新生, 林菊生. 过继免疫疗法在慢性乙型肝炎治疗上的应用. 世界华人消化杂志 2005;13(23):2778-2782 http://www.wjgnet.com/1009-3079/13/2778.asp 0  引言 目前, 多数学者认为HBV感染慢性化的主要机制是宿主对HBV各种抗原产生不同程度的特异性免疫无应答, 即免疫耐受. HBV可以经胎盘传染胎儿, 胎儿免疫系统尚未发育成熟, 体内HBV特异性T细胞因阴性选择而导致克隆清除. 多数实验结果表明成人感染HBV的免疫耐受主要机制为个体免疫系统不健全. 如Th1/Th2细胞失衡, HBV感染免疫细胞等. 总体来说, 乙肝慢性化与个体特异性免疫功能减弱有关. 过继免疫治疗(adoptive immunotherapy)是将体外激活的免疫活性细胞或细胞因子进行免疫性转移, 输给肿瘤或感染病毒的宿主, 使他们在体内产生协同作用, 由免疫活性细胞杀伤、溶解肿瘤或病毒感染的细胞, 直接或间接地介导机体的抗肿瘤或抗病毒效应. 过继免疫疗法因为可以借正常个体的免疫功能来协助或纠正有免疫功能障碍的患者, 故在慢性乙肝治疗上有较好的应用前景. 我们将对此进行综述. 1  骨髓移植 (BMT) 疗法 既往临床观察表明, 一些合并HBV感染的血液病患者接受乙型肝炎表面抗体(抗-HBs)阳性供者骨髓后, 在造血和免疫功能重建的同时, 其体内的HBV也被清除. 近年来, 随着研究者对这一现象的认识逐渐深入, 有关研究报道不断增多[1-3]. Shouval et al[4]研究发现: 用重组的乙型肝炎表面抗原(HBsAg)免疫供者小鼠, 然后将其骨髓移植给免疫抑制的受者小鼠, 受者体内可检测到抗-HBs, 提示供者对乙型肝炎的免疫功能已转移到受者体内. Lau et al[5]报道21例合并HBV感染的患者, 其中5例接受抗-HBs/抗-HBc阳性的骨髓移植, 2例产生持续的HBsAg阴转和抗-HBs阳转, 这2例患者移植前HBeAg和HBV DNA均为阴性, 且均为成年人; 1例发生一过性阴转. 而2例未发生阴转者均为儿童, 且病毒为高复制, 其中1例患者与供者HLA抗原有2个位点不一致, 另1例接受经疫苗免疫产生抗-HBs的供者骨髓. 另16例接受抗-HBs阴性供者骨髓的患者, 无一例发生阴转, 说明过继免疫在HBV的清除中起重要作用, 但也可能存在其他因素的影响, 如病毒复制的水平, 获得免疫的方式等. 随后Lau et al[6]又观察了13例接受抗-HBs阳性供者的骨髓, 其中抗-HBs/抗-HBc阳性6例, 抗-HBc阳性7例, 4例HBsAg阴转, 抗-HBs转阳, 且全部都是接受抗-HBs/抗-HBc阳性骨髓的患者; 而7例接受仅抗-HBs阳性的患者无一例阴转, 故有人认为疫苗免疫对于HBV的清除是不足的, 而且发生清除的时间一般在BMT后3-6 mo. Lau et al[7]研究受体体内淋巴细胞后, 发现了受体体内T淋巴细胞来源于供体, 并且是针对核心C抗原, 而不是针对表面抗原, 这证明了上述现象发生的机制. 对于合并HBV感染的需移植者, 接受BMT后, 常需要大剂量的免疫抑制剂治疗, 这很可能诱发肝炎的活动, 甚至发生重型肝炎. Caselitz et al[8]研究认为在合并HBV感染的移植患者中, 由于肝衰竭引起死亡的可能性至少部分与HBV的再活动有关. Chen et al[9]报告了43例接受BMT的HBV感染者, 其中32例接受异基因BMT, 11例接受自体BMT. 随访1-11 a, 接受异基因BMT的患者有26(81.3%)例发生肝功能损害, 5例发展为暴发型肝炎; 在接受自体BMT的患者有4(36.4%)例发生肝功能损害, 无一例发生暴发型肝炎, 提示自身移植的安全性较高. Lau et al[5]报道4例接受抗-HBs阳性供者的骨髓发生HBV清除的患者中, 虽然均出现不同程度的肝损害, 但没有出现暴发型肝炎, 原因可能与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的非细胞毒性作用机制有关. 反之, 乙肝抗体阳性的患者接受乙肝病毒携带者骨髓移植, 则有发生爆发型肝炎的报道[10].     不少研究者[11-13]发现: 骨髓移植致死性并发症中, 肝损害, 特别是在HBV阳性患者中, 是主要诱发因素. 如何防止和减少HBV感染者接受BMT后发生肝脏损害, 是目前需要解决的一个问题. Daily et al[14]报道, 应用丙种球蛋白肌注能起到预防作用. 最近, Lau et al[5]报道应用泛昔洛韦降低合并乙型肝炎的血液病患者的病毒水平, 可减少肝脏损害的发生率. 拉米夫定在防止骨髓移植肝损害及乙肝复发上, 作用最为肯定[15-18].     上述研究表明, 接受BMT后的HBsAg阴转率明显高于自发的转换率或应用干扰素后的阴转率, 在目前尚缺乏有效清除HBV治疗手段的情况下, BMT过继免疫给我们提供了一种治疗慢性乙肝的思路.

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２  外周淋巴细胞输注 (PBLs) 疗法
2.1 LAK细胞疗法 1970年后Morgan et al^[19]发现白细胞介素-2(IL-2)对T淋巴细胞具有扩增和激活作用. 1982年Rosenberg et al^[20]发现: 正常人和肿瘤患者的外周血单核细胞在含IL-2的培养基中, 经2-3 d时间培养后出现显著的杀伤活性, 后将这种细胞称为淋巴因子激活的杀伤细胞即LAK细胞. 1987年开始用于慢性乙肝的治疗,到目前已有18 a的历史. 总结其治疗经验后发现: 临床上有反复轻度肝功能受损, ALT轻度升高, HBeAg阳性或HBV-DNA阳性, 但滴度较低的患者效果较佳. 其HBeAg阴转率近期为44%, 远期为58%; DNA则分别为57%和70%. 应用LAK细胞治疗效果, 受个体免疫状态的影响, 免疫低下者效果差. 由于LAK细胞治疗中需要使用大量IL-2, 而IL-2可引起毛细血管渗透性增加综合征. 一般不良反应有发热, 恶心, 乏力, 肌肉酸痛, 严重的有败血症. 目前研究的方向是寻找更有效果的LAK前体细胞(脐血, 骨髓, TIL细胞等); 改善LAK细胞诱导方法(加入抗CD3, IL-7等); 改变LAK细胞的输注途径(通过肝动脉导管). 这些研究或多或少的提高了LAK细胞的疗效, 减轻了其治疗的副作用.
2.2 树突状细胞(DC)疗法 树突状细胞(dendritic cells, DCs), 顾名思义为一种边缘有树枝状突起的大细胞, 在体内含量极少, 但却发挥着非常重要的作用, 是机体识别外来抗原(病原体)和自身变异抗原(肿瘤抗原等)的最重要的抗原递呈细胞. 越来越多的证据表明由DC激活的细胞免疫, 特别是CTL介导的免疫反应, 通过杀伤感染的肝细胞和释放抗病毒的细胞因子来清除HBV. 尽管血中存在高浓度的病毒抗原, 慢性乙肝患者没有启动有效的免疫反应. 作为起核心作用的DC细胞可能与慢性乙肝患者对病毒抗原的这种弱反应有关. 现已有研究表明包括HBV在内的多种病毒感染中, 均存在抗原递呈功能缺陷^[21-23]. Wong et al^[24]还发现在乙肝相关性肝癌患者体内, 树突状细胞也存在缺陷, 这种减弱的抗原呈递功能可通过肿瘤抗原致敏增强. Akbar et al^[25]通过用HBV转基因鼠模型研究HBV感染后机体免疫耐受状态与DC等免疫细胞功能的关系, 发现这种状态并不是因为淋巴细胞功能缺陷, 而是由于抗原递呈功能缺陷, 特别是DC功能缺陷引起. Yan et al^[26]研究经过干扰素治疗的慢性乙肝患者体内树突状细胞亚类数量变化, 发现对干扰素治疗有效果的患者体内树突状细胞特别是髓系树突状细胞明显升高, 也间接证明了树突状细胞在乙肝病毒清除中的关键作用. 因此, 诱导成熟的DC细胞进行免疫过继治疗, 可能会取得对慢性乙肝患者重建细胞免疫的作用. DC用于抗病毒的免疫治疗的基本方法是: 体外用细胞因子诱导扩增DC, 并用病毒抗原冲击致敏, 再将致敏的DC回输到体内, 诱导出特异性的CTL, 从而发挥抗病毒作用. 为了能保持高水平而持久的抗病毒免疫应答, 可用病毒抗原多肽基因修饰DC, 使之持续表达基因产物. 因此, 寻找更有效的基因载体, 转染DC就成为目前的主要研究方向. 目前用重组腺病毒以及腺相关病毒作为载体, 转染细胞因子如GM-CSF, IL-12, IL-7以及乙肝抗原(S, C, E)等基因入DC, 诱导出的特异性CTL, 据初步研究^[27-29], 杀伤作用提高显著. 据初步临床实验^[30], 树突状细胞疫苗应用于人体是安全有效的. Gao et al^[31]研究树突状细胞和血清HBV-DNA水平和肝脏炎症程度关系, 发现DC2数量和病毒数正相关, 而DC细胞数量和肝脏炎症积分无明显相关性, 这表明树突状细胞可能通过激活CTL, 针对的是乙肝病毒, 因而不会加重肝脏细胞损伤. Chen et al^[32]用表面抗原致敏的树突状细胞治疗19例慢性乙肝患者, 10 名(52.6%)患者E抗原转为阴性; 2例联合拉米夫定的患者获得完全应答. 初步疗效表明与干扰素相当, 并发现合用拉米夫定效果更佳. Furukawa et al^[33]发现用表面抗原致敏的树突状细胞疫苗, 防止慢性乙肝患者肝移植术后复发, 取得较好效果. 现已取得一些进展, 但抗乙肝病毒治疗方面没有开展大范围的研究, 能否用于清除HBV, 尚待进一步研究.
2.3 CIK细胞疗法 CIK细胞全称为多种细胞因子诱导的杀伤细胞, 1991年美国斯坦福大学医学院骨髓移植中心首先报道了这种高增殖力和高细胞毒性的细胞因子激活的杀伤细胞的培养方法. 1994年Lu et al^[34]报道了体外大量增值CIK细胞的方法后, 在全世界范围内引起了普遍的关注. 国内外很多学者对其细胞来源, 免疫学特性, 抗病毒抗肿瘤的杀伤效能都作了深入的研究和阐述. Tong et al^[35]在体外试验中比较了CIK细胞和LAK细胞的杀伤作用: CIK细胞最强毒力在培养第10-28 d, 可杀伤2.5-3.5个对数级的肿瘤细胞, 而LAK细胞仅杀伤0.5-1.5个对数级细胞. 由于CIK细胞具有非MHC限制性, 高增殖活性, 高细胞毒力, 细胞来源丰富等优点, 目前已经开始试用于治疗慢性乙型肝炎. 体外试验发现, 加入纯化HBsAg共培养后, 可以诱导CIK细胞产生特异性杀伤作用. 已有研究表明^[36], 慢性乙肝患者CIK细胞同样存在缺陷. 因此怎样加强其杀伤活性为目前研究重点. 目前通过转染CIK细胞以及与树突状细胞共培养, 实验证明能够大大增强其杀伤活性^[37,38]. Gao et al^[39]对16名慢性乙肝患者用CIK治疗52 wk, 取得较好效果, 完成治疗的14名患者中, DNA转阴, HBeAg/anti-HBe血清转换, 及肝功能恢复正常的各占42.86%(6/14). 但CIK细胞用于临床治疗慢性乙型肝炎的经验和报道仍然很少, 其清除病毒的机制和效果尚需更多的研究来阐明. 其他淋巴细胞, 如自然杀伤细胞即NK细胞^[40], 趋化因子活化的杀伤细胞即CHAK细胞, 初步研究表现出了较好的应用前景. Maghazachi et al^[41]通过研究CHAK细胞体外常规生物学活性发现: CHAK细胞是一类不同于PBMC细胞及LAK细胞的新型免疫杀伤细胞, 虽然其在诱生初期并不比LAK细胞强, 但随着培养时间延长, CHAK细胞逐渐显示出更强的杀伤活性, 且杀伤功能维持时间较LAK细胞久.

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３  其他过继免疫疗法
3.1 造血干细胞移植 由于HBV不仅能感染患者的骨髓基质细胞, 而且还感染患者的外周血淋巴细胞, 且骨髓移植风险较高; 因此, 有研究者将目光投向了造血干细胞. Ilan et al^[42]观察了12例接受HBsAg阳性供者的造血干细胞移植的患者, 其中HBsAg阳性8例, 阴性4例. 随访13.2 mo(中位数), 8例HBsAg阳性患者中有1例死于肝衰竭, 1例ALT升高; 4例阴性患者无一例发生HBV感染. 因此认为, 造血干细胞移植可能会减少HBV感染, 且HBsAg阳性并不是造血干细胞移植的反指征, 除非HBV处于高复制水平. Chiba et al^[43]报告一例慢性乙肝患者因急性淋巴细胞白血病而接受外周血干细胞移植, 供体为单纯乙肝表面抗体阳性. 结果获得彻底痊愈. 因患者应用拉米夫定, 并认为拉米夫定可能起协同作用.
3.2 肝移植过继免疫 其在动物实验中也显示出了良好的前景: Li et al^[44]对28只小鼠实施原位肝移植, 对21只小鼠实施骨髓移植作为对照. 供体小鼠均为乙肝表面抗原疫苗注射后并出现抗-HBs, 阳性, 结果接受肝移植的小鼠有23只(82%)出现了抗-HBs, 并持续了2-9 wk. 而接受骨髓移植的21只小鼠有19只(90%)出现了抗-HBs, 并持续了2-12 wk. Dahmen et al^[45]亦有类似报道: 对34只小鼠实施原位肝移植, 供体为抗-HBs小鼠. 结果29只(85%)出现了抗-HBs并持续了2-10 wk, 且受体和供体最大滴度无明显差异. 上述研究显示出了肝移植可能作为过继免疫的一个手段, 其机制及能否临床应用有待进一步研究.

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４  展望
随着对乙型肝炎慢性化和免疫耐受机制的揭示, 免疫调节疗法在慢性乙肝治疗中将发挥越来越重要的作用. 骨髓移植是一种彻底的免疫重建, 最有希望达到完全清除HBV的目的. 但骨髓移植死亡率高, 花费大, 限制了其在临床上的应用. 因此, 深入探讨其过继免疫的作用机制, 改进移植方法, 有望使这一方法应用到慢性乙肝的治疗中. 外周淋巴细胞输注疗法, 是比较安全, 操作较为方便,已经应用于临床^[46], 并取得较好效果的免疫过继疗法. 因为慢性乙肝免疫耐受机制可能与多种淋巴细胞功能缺陷相关, 从多方面不同角度着手, 如: 积极改善培养方法^[47], 混合淋巴细胞(LAK, CIK, DC等)培养及输注^[48-50], 以及联合抗病毒药物, 导入某些免疫佐剂^[51-53]及抗原片段等^[54-56], 理论上能增加过继免疫疗效, 上述体外试验也表明能取得更好效果. 但应用于人体的有效性尚需进一步较大规模临床试验加以证明. 怎样增强外周血淋巴细胞活性, 如导入某种基因片段等, 联合应用生物反应及免疫调节剂, 可能为今后研究方向. 因慢性乙肝患者个体免疫缺陷不尽相同, 针对个体免疫缺陷的病因有针对性的辨证应用, 能否指导临床应用有待进一步研究.

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电编 张敏 编辑 菅鑫妍 审读 张海宁