丙肝疫苗研究近况

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New Perspectives for T Cell-based Hepatitis C Vaccines Are the Focus of Review
http://www.therapeuticsdaily.com
Vaccine Weekly - Aug. 30, 2006
 
Aug. 30, 2006--(NewsRx.com) -- A researcher reviews new perspectives for T-cell-based hepatitis C vaccines in a recent issue of the Journal of Hepatology.

According to the review, "Three percent of the world's population is chronically infected with the hepatitis C virus (HCV) and at risk of developing liver cancer. Effective cellular immune responses are deemed essential for spontaneous resolution of acute hepatitis C and long-term protection. Here, we describe a new T-cell HCV genetic vaccine capable of protecting chimpanzees from acute hepatitis induced by challenge with heterologous virus."

"Suppression of acute viremia in vaccinated chimpanzees occurred as a result of massive expansion of peripheral and intrahepatic HCV-specific CD8+ T lymphocytes that cross-reacted with vaccine and virus epitopes," said Carlo Ferrari at the University of Parma.

"These findings show that it is possible to elicit effective immunity against heterologous HCV strains by stimulating only the cellular arm of the immune system, and suggest a path for new immunotherapy against highly variable human pathogens like HCV, HIV, or malaria, which can evade humoral responses," stated the author.

Ferrari published the review in the Journal of Hepatology (New perspectives for T-cell-based HCV vaccines. J Hepatol, 2006;45(1):163-165).

For more information, contact Carlo Ferrari, Division of Infectious Diseases and Hepatology, Azienda Ospedaliero-Universitaria di Parma, I-43100 Parma, Italy. E-mail: [email protected].

Publisher contact information for the Journal of Hepatology is: Elsevier Science BV, PO Box 211, 1000 AE Amsterdam, The Netherlands.

This article was prepared by Vaccine Weekly editors from staff and other reports.

萧萧落木

Good job!

xiaomingli

Good个啥啊   这不是英文网站  是咱们中国人自己的网站  不要弄得这么洋气  还是做点实事  翻译一下得了吧~

2002落叶

丙型肝炎疫苗研究及面临的挑战

聂青和 罗新栋

 引言
丙型肝炎病毒(HCV)是引起人类慢性肝炎的主要病原体之一，呈世界流行，感染率为1-3%，约60%的急性丙型肝炎(HC)患者转化为慢性，而慢性患者中分别有8-46%和11-19%发展成肝硬化和肝细胞癌^[1]. 到目前为止，以干扰素为主的抗病毒治疗只能使30%左右的患者得到根治，尚未发现令人满意的治疗药物. a干扰素和病毒唑对治疗丙肝有一定的效果，但是副作用很大. 因此，HCV感染的防治工作更应以预防为主.HCV疫苗的研究对预防HCV感染和阻止病程进展十分重要，HCV疫苗的研究就成为当务之急的前沿课题.

1   HCV基因结构与疫苗研制
HCV是一种单股正链的RNA病毒，基因组长度为9500个核苷酸(Nucleotide，nt)，其5’端有一个319-341 nt结构较为保守的非翻译区(untranslated region，5’-NTR). 后面为一个连续的开放阅读框架(open reading frame，ORF)，几乎占据HCV整个基因组，编码长度大约为3 008到3 037aa的多聚蛋白前体，其在宿主和病毒编码蛋白酶的联合作用下，生成3种结构蛋白C、E1、E2，以及6种非结构蛋白NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a、NS5b.结构蛋白参与病毒颗粒装配，非结构蛋白参与基因的复制. HCV的3’端为27-55nt的3’-NTR，3’-NTR末端由一结构可变的poly (U-C)尾及一段极为保守的含98nt的序列(称为X区)组成. 5’末端和3’末端的高度保守提示其可能在病毒复制或翻译水平上起重要调节作用. 研究表明，3’-NTR末端的X区形成的茎环结构可与多聚结合蛋白(PTB)结合，后者通过5’-NTR基因组中的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site，IRES)增强对病毒RNA的翻译作用.
      HCV的一个主要特点及发展疫苗的一个首先要考虑的因素就是他的基因组的异源性.目前认为，造成HCV变异性是由于HCV RNA病毒复制所依赖的RNA指导的RNA聚合酶(RNA-directed RNA polymerase，RDRP)缺乏“校读”(proof heading)功能，加上病毒为适应环境和逃脱宿主的免疫清除而易发变异，逐渐形成新的HCV变异株，并各自独立演化，从而形成一定的型、亚型和准种.
      对来自全球的多株HCV序列同源性比较分析，HCV基因组遗传变异性并不一致，最保守的区域为5’-NTR和3’-NTR ORF区中，最保守的区域为核心区(C区)，编码病毒膜蛋白的基因区(E1、E2)变异较大，其中又以E2 N端的变异最大，有两个高变部位(high variableregion，HVR)，即HRV1、HRV2. 其意义在于所有的HCV分离株在此部位上均不相同. HRV1 C末端表位可有病毒株依赖性和非依赖性抗体同时存在，随病程变化亦出现抗原表位的变化，一般为N端向C末端的漂移.进一步研究提示，早期针对于HVR1 N末端抗体的出现伴随着HCV急性自限性感染，主要针对于HCV1 C末端的病毒株非依赖性抗体存在于HCV感染慢性化的患者，他们并不能有效清除病毒.
      由于依赖RNA的RNA聚合酶链反应的校对功能不完善，易出现基因突变，以及宿主免疫压力的存在，所以宿主体内的HCV会聚集成一个复杂的称之为准种(quasispecies)的病毒群体. 准种的存在可能是一个用来逃避宿主免疫的机制. 这些准种的性质及复杂性也影响预防和治疗的成功率. 深入的系统进化分析可将HCV分成至少6个主要的基因型和至少70个不同的亚型. 其中基因型1、2、3型在我国分布最广.
      大多数HCV感染者都有抗HCV核心蛋白、NS3和NS4的抗体，但是这些抗体的中和作用不明显，并且感染了HCV后抗-HCV阳性的黑猩猩受到同源或异源HCV株攻击后，仍可再次发病. 临床也发现丙型肝炎可以多次复发. 感染HCV后缺乏足够免疫力的原因可能是: (1)体内HCV病毒量很低，可能没有足够的免疫原刺激产生稳定的免疫保护力; (2)HCV RNA和病毒蛋白变异性很大，至少存在6个基因型和3个血清型，彼此间可能没有交叉保护力; (3)可能与免疫选择和进化有关的HCV E区基因变异较大，很容易形成免疫逃逸突变株.世界各地分离的部分HCV株E基因的变异率高达20-40%，甚至抗HCV-E抗体之间也没有交叉免疫反应，这是疫苗研制的一个重要障碍.另外HCV体外复制能力差，缺乏较敏感的组织培养方法，理想的动物模型亦难寻找，这些因素使HCV疫苗研制更面临巨大挑战.目前研究的方向有蛋白疫苗和核酸疫苗^[2-3]

2002落叶

2   蛋白疫苗
2.1 肽疫苗  诱导出针对多个HCV表位的特异性的细胞免疫反应对开发有效的HCV疫苗是很重要的. 在抗原设计与表达不同的HLA I类或者Ⅱ类分子的转基因小鼠模型的研究中取得的重要进展使合成肽疫苗的发展成为可能.联合运用单个或者多个HCV抗原及不同的HLA分子的抗原表位的不同多肽是令人鼓舞的. 但是对此感兴趣的人不多. 现今绝大部分工作都在确定具有免疫原性的肽而不是测试最有希望的肽疫苗.
      在肽疫苗研究中，一个经典的方法是用HCV感染患者的血清来筛选噬菌体表达的肽文库，然后选择出与患者血清特异反应的肽段. 用HCV感染的患者血清来筛选在噬菌体文库中表达的数目巨大的HVRｌ的所有肽段，可以选择出既有抗原性又有免疫原性的肽段作为那些HVRｌ发生变异的数目巨大的变异体的类似物^[4]. 现在知道如果肽序列包含CD8及CD4表位，那么经他免疫诱导的特异性CTL将十分理想. 最近有研究确定了一个序列，包含E1糖蛋白的121-135位氨基酸残基，他能在被注射的小鼠中诱导出CD4+Th1细胞及CD8+CTL.
2.2 包膜蛋白疫苗  黄病毒和瘟病毒包膜糖蛋白能诱导机体产生中和性抗体. 在疫苗研制初期，研究者把注意力投向HCV包膜糖蛋白，Choo et al对此进行了深入研究. 从感染重组痘苗病毒表达载体的HeLa细胞中得到HCV包膜蛋白E1和E2，并将E1和E2复合物注入黑猩猩体内. 结果证实7只黑猩猩中5只能抵抗10个半数黑猩猩感染量HCV的攻击. 而对照组则出现急、慢性感染，证明抗HCV-E抗体有保护作用. 但值得注意的是这种疫苗为“单特异性”，对不同基因型和血清型的HCV不一定适用. 而且是在加强免疫后抗体达到最高滴度时才能抵抗HCV的攻击. 因此如何使抗体维持在较高水平，如何克服HCV高度变异性这些HCV疫苗研究的难点仍然没有得以解决^[1,5].
      Farci et al用HCV H 77株E2区合成肽免疫兔，产生了抗同源性合成肽的高活性抗体. 将抗体与等体积含有64个CID 50的H 77株中和后再分别注射2只黑猩猩. 研究表明，H 77株至少有19种不同来源病毒株同时存在，E2中的HVR 1具有关键的抗体中和表位，从该区产生的合成肽能激发中和抗体产生并能保护黑猩猩对同源性HCV的攻击，但对HCV基因有变异的突变体没有中和作用. 一些研究显示，E2中抗HVR1与中和HCV感染有关，有人从急性肝炎患者分离的H 77株，用其HVR1区合成的21个多肽免疫家兔，用ELISA法证实该免疫血清能防止H 77株感染HPBMa细胞，但不能阻断对H 77株的突变株H 90株的感染，该结果表明，抗HVR1抗体的中和作用具有高度特异性. Rosa et al用多种E1和E2重组蛋白与人Ｔ细胞淋巴瘤细胞孵育，结果只有哺乳细胞表达的E2重组蛋白能与人Ｔ细胞淋巴瘤细胞结合，并发现E2免疫的兔血清能中和E2对靶细胞的结合作用，此种抗体叫作中和结合抗体，对HCV感染有一定的防护作用^[6].
2.3 问题与展望  HCV E1、E2蛋白疫苗免疫黑猩猩后，在抗体达到高峰时，可预防同源性HCV感染，但能否预防异源性HCV感染以及当抗体滴度下降时是否还能预防同源性感染，这些问题尚待研究^[7]. 抗E2抗体，特别是抗HVR1抗体(NOB)具有中和HCV对靶细胞的结合作用，预示着有中和同源性HCV感染作用，但这一中和抗体具有高度特异性，对突变的HCV及HCV准种株没有中和作用，而且蛋白类疫苗诱导产生的抗体浓度随时间而下降.
      尽管目前取得了一些进展，但是HCV蛋白疫苗的发展还是处于一个早期阶段. 许多策略也证实对小鼠能诱导出强烈的长时间的Ｔ细胞介导的免疫反应，对灵长类也取得了一些进展. 对于这些候选疫苗解决诸如诱导反应的记忆以及对他们的交叉反应能力这些问题是十分重要的. 认真选择合适的佐剂或者使用细胞因子、化学因子及协同刺激分子可能也很重要. 目前使用的所有疫苗都是防止急性感染. 急性HCV感染通常是轻微的不显著的，HCV带来的问题主要是持续性感染，并通常导致临床上显著的慢性肝脏疾病. 另外，慢性感染患者通常又是HCV的主要传播者.
      由于HCV具有多个基因型及血清型，膜蛋白区同源性小，加之基因突变率高，容易形成没有逃逸病毒株，缺乏具有交叉免疫保护效应的中和抗体，这些诸多因素给HCV免疫研究带来了极大困难，我们必须突破常规研究策略，探索新的疫苗技术，才能推动和促进HCV疫苗的研制^{[4, 8]}.

3   核酸疫苗
HCV基因疫苗是将HCV上某一片段目的基因克隆入适当的表达载体中再接种到体内，以使目的基因得以表达，来诱导机体产生特异的体液免疫和细胞免疫达到清除HCV病毒感染的目的. 由于HCV结构的变异，目前尚未确定特异性的抗原决定簇，为此国内外学者对HCV结构区的不同基因片段构建的疫苗进行大规模动物试验^[9-11].
      1990年Wolff et al发现质粒DNA直接肌肉注射可诱发特异性免疫应答，拉开了疫苗研究“第3次革命”的序幕. DNA疫苗又称基因疫苗，核酸疫苗、基因免疫等，是一种新型的亚单位疫苗，可直接将重组质粒注射到动物细胞中，通过Ｔ小管和细胞膜“穴样凹陷”摄入质粒，利用宿主的复制、转录与表达系统，在肌纤维细胞等表达出接近天然构像的抗原，经抗原提呈细胞的处理后，多肽与MHC分子形成复合物被提呈到细胞表面，诱发特异性CTL效应及体液免疫应答. 与传统蛋白质疫苗相比，这种DNA疫苗明显优于传统疫苗. DNA疫苗克服了传统病毒减毒疫苗、灭活疫苗或多肽疫苗所造成的抗原决定簇的改变，保持了完整的免疫原性; DNA疫苗既可诱导体液免疫又可诱导细胞免疫，而以后者为主要特征; DNA疫苗可在体内长期、稳定表达外源蛋白，这为研制和开发利用多基因型与基因突变率高的病毒性疾病疫苗提供了理论依据.
3.1 C区DNA疫苗  在整个基因组中，C区基因型相对保守. 1995年Lagging et al 构建了Ｃ基因(第1-191aa)重组质粒pCDNA3 HCV corE，0.2 mg质粒肌肉注射免疫BALB/c小鼠2-3次后，于第6 wk处死小鼠，可检测到较高水平的抗C抗体，免疫2次或3次的抗体滴度相似.免疫小鼠中还可检测到针对Ｃ蛋白一个保守10肽LMGYIPLVGA(第133-142 aa，C7 A10)的淋巴细胞增生反应，增生刺激指数为7.5-10.5. 用痘苗病毒表达载体vv/HCV1-967感染pCDNA3 HCV corE重组质粒免疫小鼠的脾细胞后，37 ℃培养7 d，制备效应细胞. 靶细胞选用BALB/c3T3细胞，同样用vv/HCV1-967刺激，当效应细胞: 靶细胞=100∶1时，靶细胞的溶解率为22-26%，而对照载体组只约为4%，证实免疫小鼠脾细胞中存在特异性CTL前体，Ｃ蛋白免疫后可诱发特异性CTL效应. 用表达Ｃ蛋白的载体pHCV2 2(Ｃ基因)及pHCV4 2(5’UTR+C基因)分别转染人肝癌细胞株HuH7、人横纹肌肉瘤细胞株RDj及鼠成肌细胞株G8后，在胞内表达了Mr2 100的Ｃ蛋白，pHCV2 2表达效率高于pHCV4 2. 0.1 mg质粒DNA免疫BALB/c小鼠后，只有40%诱发了低水平的抗C抗体，这与Lagging et al 报道的Ｃ蛋白可诱发较高水平抗体反应有所不同，可能与他们各自使用的抗原检测系统的敏感性不同有关.
      1997年saito et al构建了多种pRC/CNN真核表达载体，分别编码HCV核心-(pC)、E1(pE1)、E2(pE2)、C与E1和E2的复合体(pCE1E2)、E1和E2的嵌合体(pE1E2)、以及除去N端的HVR的E2载体(pE1-HVR).这些载体在大肠杆菌内扩增，纯化后转染293细胞，然后将质粒DNA注射到BALB/c小鼠骨骼肌内，结果这些重组质粒能够激发抗HCVC、E1和E2的特异性抗体应答. pE2-HVR也可激发抗E2抗体应答，而且注射编码C区及其他结构区组的质粒还可检出特异CTL应答. 这些结果提示HCV C区将有助于HCV疫苗的研制.有国内学者在HCV DNA疫苗方面做了不少实验，也得到了类似的结果. 以上实验说明，HCVC区构建的重组质粒均能在真核细胞中表达，且能诱导出特异性体液免疫和细胞免疫，加上C区相对保守，是研制HCVDNA疫苗的主要靶抗原之一.
3.2 E区DNA疫苗的构建及免疫反应  由于E抗体具有中和作用，故E蛋白在DNA疫苗中的作用受到重视.Tedeschi et al构建了重组E2DNA表达载体，免疫12只Balb/c小鼠，通过免疫荧光法检测到E2蛋白的表达，于免疫后第2 wk开始可检测到抗-E2抗体，并且确定E2至少有两个线性抗原表位. Lee et al构建了不同的含有HCV/E基因的表达质粒，其中有HCV/E和GM-CSF融合基因质粒，结果显示GM-CSF基因也得到表达，并可加强HCV/E的体液免疫和细胞免疫反应，提示GM-CSF可增强HCV/E的免疫效果. 现已证明，HCV E区E2上至少有2个中和位点，与病毒的清除有关. 由以上结果可以推断，HCV E可能是今后HCVDNA疫苗的重要研究方向，但E区的高度变异给疫苗的研制带来了一定的难度.
      Fournillier et al以HCVＩa基因型E2区不同基因片段构建了3种不同重组体，用im或im加iE等不同途径免疫小鼠，抗体阳性率在60-100%之间，其中以im加iE方法效果最好，iE方法其次，主要是IgG2a、IgG2b，没有检出IgG1，显示出Th1样抗体反应. 免疫鼠脾细胞还可分泌IFNg，但未检出IL4.可见HCV DNA免疫，im加iE是最有效的方法.
3.3 HCV C+E区DNA疫苗的构建  1997年Saito et al将编码结构区(C+E1+E2)基因片段(341-2449nt)克隆入含CMV启动子的PRC载体中，构建HCV结构区DNA疫苗，通过哺乳细胞体外表达和免疫小鼠研究证实，其不仅能在Human293、BALB/3t3、cos1中表达C、E1、E2蛋白，而且还能诱导BALB /c小鼠产生抗体和特异性CTL的活性.另有人用HCV C+E2序列构建的质粒DNA疫苗免疫小鼠能诱导特异性的CTL活性、抗 C和抗 E2抗体应答，和Th1为主的增生有关.
3.4 NS区 DNA疫苗的构建  1996年Kurokohchi et al证实在HCV NS3区存在一个CTL表位，其最小单位由10肽组成，推测其可作为HCV DNA疫苗构建的有效. 但近来对HCV NS区疫苗构建的报道研究较少，可能与NS区编码的非结构蛋白抗原性及诱导宿主产生特异性免疫应答反应较弱有关.
3.5 HBV/HCV嵌合核酸疫苗  有学者在先前研究基础上用HCV C区和HBV前S1、前S2、S构建了9种不同重组体，转染不同细胞系，然后再免疫小鼠. 结果显示，HCV C区蛋白及不同嵌合蛋白均可在转染细胞中表达，并可激发和增强小鼠CD4+Ｔ和CD8+CTL对HBV和HCV融合蛋白反应，免疫强度与CD4+Ｔ淋巴细胞产生的Th1样细胞因子水平有关.这种HBV/HCV联合核酸疫苗正在研究中，推广及应用也符合今后疫苗发展的方向.对于一些低免疫原性的多肽，插入到其他蛋白质中则可能诱发理想的免疫应答.因此，嵌合表达的HBV/HCV融合蛋白质的免疫原性可能更好.
3.6 存在问题及展望  与传统的蛋白质疫苗相比，DNA疫苗有诸多优点: (1)可激发机体全面的免疫应答; (2)可表达接近天然构象的抗原，抗原性强; (3)能联合免疫，既可将编码不同抗原的基因构建在同一个质粒中，又可将不同抗原基因的多种质粒联合应用制成多价疫苗;(4)制备简单，成本低，易运输; (5)既有预防又有治疗作用^[11].
      但是仍有许多实际问题阻碍了HCV疫苗的发展^[11-12]. 主要体现在: (1)HCV属RNA病毒，具有高度的变异性;(2)难以体外培养; (3)只对人及黑猩猩易感; (4)缺乏有效的体外复制系统; (5)此外HCV DNA疫苗的安全性仍有许多方面值得探索，比如外源DNA与染色体整合、免疫耐受、自身免疫及激活癌基因、抑癌基因失活以及产生抗-DNA抗体等. 虽然目前在动物实验中未出现此类现象，但仍需进一步观察.
      目前，从国内外学者在HCV DNA疫苗的构建、免疫效应及安全性方面做的大量研究来看，虽未发现因使用DNA疫苗而引发肿瘤和自身免疫功能紊乱的报道，但也有若干问题值得关注: (1)HCV DNA疫苗引起的机体免疫应答能否起到预防和清除HCV感染作用; (2)鉴于细胞免疫应答可介导组织病理性损伤，HCV DNA疫苗诱发的CTL反应能否引起肝脏的病理学变化; (3)由于免疫对抗作用的限制，尚不能构建来自多个不同HCV基因型的融合DNA疫苗; (4)HCV DNA疫苗能否引起机体产生免疫耐受; (5)由于目前的研究大多仅局限于小鼠，其作用机制和灵长类动物之间还有很大的差异等等. 所以，在HCV DNA疫苗研制方面还有大量的理论和实验工作要做^{[11, 13]}.
      总之，丙型肝炎疫苗虽然还未有突破性进展，但随着对HCV免疫机制的进一步了解，通过对体外复制模型的进一步完善及增强免疫效果的研究. 相信在不远的将来，HCV疫苗的研制会有一定的突破.

黑色眼睛

向战斗在医学科技前沿的科学家致敬!!

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