治疗性乙型肝炎疫苗研究进展
冯立，胡显文，陈惠鹏
乙型肝炎是最常见的传染性疾病之一。据统计，全球已有20多亿人经历了HBV感染，这其中有3．5亿为慢性HBV携者，我国占1．2亿 1。每年全球都有100万一150万的病人死于急性或慢性HBV感染导致的肝硬化、肝功衰竭和肝癌。预防和治疗HBV感染迫在眉睫。20世纪70年代以来，研究偏重于预防性乙肝疫苗的研究，基于安全性、糖基化、放大生产和价格因素的考虑，目前市场上广泛应用的是酵母系统表达的重组乙肝表面抗原(HBsAg)疫苗。通过对医护人员、婴幼儿等易感人群免疫接种，发现HBV的感染率显著下降，健康成人中免疫后血清可达到很高的转换率。但仍有l0％左右的人发生病原体逃避免疫清除而成为乙肝病毒原携带者或持续感染的慢性乙型病毒性肝炎(chronic hepatitis B，CHB)病人。目前对他们的治疗主要采用干扰素和拉米夫定等药物抗病毒治疗，效果不很理想，且费用高，需要开发价格适宜，可激发更高免疫应答的药物。对治疗性乙肝疫苗的深入研究有望打破机体耐受状态并最终清除病毒感染。本文对基因重组手段构建的一系列治疗性疫苗作一综述。
1 蛋白疫苗
蛋白质抗原是最重要的一类抗原，HBV中多以衣壳蛋白和HBc抗原设计为主；其中，前S蛋白有很高的免疫原性，可以强 化同存的S蛋白。研究者应用分子生物学的方法对天然乙肝抗 原分子进行设计、修饰和改造，构建了一系列基因工程疫苗。
1．1 亚单位疫苗
乙肝衣壳蛋白中preS1、preS2、S和HBcAg的任一组合构成了亚单位疫苗。据报道，分别应用商业化的preS2／S疫苗(Gen． Heyac B@ ，Pasteur—Merieux)或S疫苗(Recombivax@ ，Merck)对 CHB病人进行治疗，给药后6个月，疫苗组病人血清HBV DNA 的阴转率下降明显(疫苗组：非疫苗组为l5．5％：2．7％，P=0．038)； 特别是在治疗前曾发生过病毒血症(t>200 pg／mL)且对IFN的反应性很低的患者，疫苗的疗效更好(非疫苗组：疫苗组为0： l6．7％，P--O．025)。在治疗的第6-12月之间，疫苗组比非疫苗组 更能明显地降低体内HBV病毒载量( 0．04)。虽然在HBe／抗 HBeAg转换的比率上无显著性差异，但是给药6个月后只在疫 苗组发生HBeAg转阴，并检测到抗HBe抗体(S组：preS／S组：非 疫苗组为8％：l5％：0％) 。此外，疫苗组7／27例、非疫苗组0／l3 例会引起外周血单核细胞(PBMC)增殖反应，这是一种由CIM T 细胞介导的、针对表面抗原(至少识别3个不同的表位)做出的 应答121。这项多中心对照研究证实了亚单位疫苗能够减低HBV 的复制，但疗效仍很有限[21。 陈心春等应用HBcAg／preS1融合抗原免疫BALB／c小鼠， 观察到小鼠体内有高滴度的抗-HBc，在第9周终点滴度最高为 l：12800，平均为1：2935．84；抗一preS1的滴度比前者稍低，两者的 滴度均与观察时间和免疫抗原剂量呈正相关。且小鼠免疫后均 倾向于产生IgG2a占优势的rI1ll型T细胞应答1"31。用这种融合蛋 白治疗模拟CHB状态的转基因小鼠，结果表明能有效地抑制转 基因鼠HBsAg表达和HBV DNA的复制 。这是个令人鼓舞的结 果，为今后治疗性乙肝疫苗的制备提供了新的思路。
1．2 免疫原性复合物(immunogenic complex，IC)疫苗
对HBsAg的免疫耐受是引起CHB发病的重要原因。20世 纪90年代，闻玉梅等构建了HBsAg联合乙型肝炎免疫球蛋白 (HBIG)并以氢氧化铝为佐剂的IC疫苗，命名为HBVac—HBIG。 研究旨在通过IC改变对HBsAg的呈递方式，诱导有效的免疫， 消除免疫耐受。该疫苗不仅在HBsAg低反应鼠中可诱生抗一 HBs．还可在HBsAg转基因鼠中清除部分鼠的HBsAg及诱生抗一 HBst~。随后，对l4例CHB病人进行免疫治疗的结果显示，有9 例(64．3％)血清HBV DNA阴转，6例(42．9％)HBeAg阴转，未出 现免疫综合征相关的症状，说明这类IC疫苗起到了治疗作用嗣。 通过对小鼠的实验研究，揭示了这一疫苗的作用机理：IC中抗体 Fc段与APC表面的受体结合，促进APC摄取IC，通过改变抗原 的呈递方式，诱发了比单独HBsAg免疫更显著的CTL细胞免疫 应答，同时释放更高水平的IFN一．y等TH1型细胞因子 。但此类 疫苗存在着对细胞免疫应答的激发远高于对体液免疫应答的激 发的不足，因此需要进一步优化。优化方法可采取以IC自身作 为佐剂即通过增大相对分子质量，易于吞噬细胞吞噬的特点来 加强免疫；或研制以中药成分为佐剂的IC疫苗，免疫后ALT复 常率92．9％ ，HBV—DNA转阴率5O％ ，HBeAg转阴率41．9％ 。尤其 对慢性活动性肝炎疗效好，但远期疗效有待进一步证实r7】。
近年来，人们还发现裸露的DNA质粒(sDNA)也可以作为佐 剂加强IC的免疫效果。包括IC—sDNA复合物在内的4类疫苗免 疫转基因鼠的结果表明：IC—sDNA通过抗体的中和效应，显著地 降低血清中的HBsAg，而非肝细胞中的HBsAg水平；同时，它还 可以更好地刺激细胞免疫和诱导细胞因子的产生，如产生高效 的CTL活性和高水平的IFN一．y圆；体液和细胞免疫均比重组的 HBsAg、IC或sDNA有所提高，可以作为一种新的手段治疗HBV 慢性携带者和慢性患者的方法。机制研究表明：除了具有IC类 疫苗的促进抗原提呈的特点外，IC—sDNA复合物能够诱导内源 和外源抗原的提呈，诱导宿主产生强烈的CD4 和CD8 T细胞免 疫应答圆。此外，DNA质粒还可以防止酶介导的蛋白降解，而细菌 中的CpGs成分也可作为佐剂，进一步提高复合物的免疫原性旧。 闻玉梅以免疫球蛋白为载体，将多个表位克隆于抗体上，获得了 在不同MHC个体中均有反应的多功能IC，其疗效还有待进行深 入的研究。
l-3 表位疫苗
由于蛋白质抗原不是通过完整的分子发挥作用的，抗原分子表位的研究是近年来新的研究趋势— — 有效的保护取决于一 组表位的组合与搭配。通过对蛋白质抗原的B细胞表位、Th细胞 表位、CTL细胞表位、NK细胞表位及MHC限制位等有利于免疫 识别表位的深入研究，为设计新一代高效、高特异性疫苗奠定了 基础。
1．3．1 针对CTL表位的脂肽疫苗
由于单独的CTL表位仅有很 小的免疫原性，所以Vitiello等在CTL显性表位之一HBcAg的 l8～27位氨基酸序列基础上，与之共价结合破伤风类毒素830~ 843肽段作为Th表位，并在N端连接2个棕榈酸分子构建了 Theradigm—HBV脂肽疫苗，来加强其免疫原性。对26例正常人 进行免疫的结果表明，500 P,g剂量可以诱导较强的特异性CTL 应答，并表现出良好的安全性和耐受性 。但是对CHB患者进行 免疫治疗，发现其体内产生的CTL应答明显低于急性HBV感染 者所测得的结果『lq，这种低水平的CTL应答是不能清除病毒的。 分析原因可能是由于慢性HBV感染者体内，I1hl类因子IFN一．y 和IL—l2分泌减少，，I1hl／I’h2类细胞因子失衡所致m】。此外，这种 疫苗不仅裂解内源性抗原肽，同时也裂解感染的肝细胞，若应答 过强会导致肝功恶化；且它具有严格的HLA—A2限制性，应用范 围有限。近年来，采用特异的或非特异的免疫刺激物(IL—l2， IFN一．y)和抗病毒药物(如拉夫米定)的综合治疗有望逆转已经改 变的Th功能 。或者选择一种能产生更强辅助性T细胞表位 (HTL)活性的表位如PADRE，经转基因小鼠实验证实，在CTL水 平上打破免疫耐受状态，以达到治疗效果ll”。
1．3．2 多表位疫苗 第一军医大学构建了多表位疫苗，在HBV 基因组中优选了5个高度保守的HLA表位识别肽，分别来自表 面抗原、核心抗原及HBV DNA多聚酶。此外，还包括HTL及 CpG 岛核心序列。在大肠杆菌和哺乳动物细胞NS—l中表达， Westen印迹结果显示，抗HBV患者的血清可特异识别此融合蛋 白，提示该重组蛋白具有很强的抗原性和较理想的免疫原性。它 的设计注重了免疫功能的发挥和T／B细胞的协调作用ll31，为预 防和治疗用乙肝疫苗提供了新的侯选物。
最近，甘慧等将HBV preS1(27~47)+亲水性连接肽+preS2 (133～145)2个中和表位引入HBc(1～l44)的elloop(79~80)位 点，获得了HBV多表位嵌合基因，并在大肠杆菌中大量表达出 病毒样颗粒融合蛋白；酶联免疫试验、免疫印记结果显示2个中 和表位成功地表达在HBcAg颗粒表面，呈现出HBcAg、pre—S1、 preS2抗原性㈣。对于健康者，其通过体液免疫应答有效预防乙肝 病毒感染；对于CHB患者，B细胞表位通过诱导特异性抗体中和 细胞外游离的病毒，T细胞表位可通过激活特异性，I1h和CTL识 别，杀伤、破坏病毒感染细胞，清除胞内感染的病毒，起到预防和 治疗功效 。
2 核酸疫苗
核酸疫苗包括mRNA和DNA两种形式，但多为DNA，故又 称DNA疫苗。机体通过引入的DNA编码产生相应的抗原肽而 诱导免疫应答。在证实了DNA质粒可以在肌细胞中表达编码的 蛋白的基础上，人们应用编码乙肝病毒抗原的质粒DNA进行预 防和免疫治疗f1 。由于DNA疫苗可启动更有效的抗原提呈途径， 能促进机体合成内源性抗原，提呈相关表位，大量产生CD8 的 CTL细胞，所以这类疫苗也可以作为治疗CHB患者的侯选物；它
能够在一定程度上克服对传统抗原的依赖。 2．1 单价核酸疫苗 治疗性疫苗就是通过激活特异性CTL应 答来清除CHB患者体内的HBV，所以目前研究主要集中在与激 发CTL活性相关的HBs、preS1、preS2和HBc基因上。如HBS DNA疫苗，采用编码HBS的DNA对小鼠进行肌注免疫。小鼠免 疫系统能够通过识别HBsAg、preS2或preS1结构域上的多个B 细胞表位 q，产生快速、强而持久的体液和细胞介导的免疫应答， 大量的CTL和CTL前体细胞在第l周就可以检测到，并且能够 维持许多月旧；在第4～8周出现高滴度的抗HBS抗体，至少持续 l7个月。对模拟CHB的转基因鼠的免疫发现机体产生抗HBSAg 的抗体，后者能够诱导循环中HbsAg的清除；这种清除是持久 的，可能与肝中的HBV信使RNA减少或消失有关㈣。此外，还有 HBc／HBe DNA疫苗，HBcAg不但具有高度免疫原性，而且对 HBsAg起到，I1h功能；而HBeAg作为慢性感染过程的耐受原，是 病毒产生免疫逃避和免疫耐受的主要原因。用这2种质粒DNA 免疫小鼠，可有效地产生特异性的抗体，重要的是产生非常强烈 的主要组织相容性复合物(MHC)类限制性CTL应答。也可以用 来对CHB患者进行治疗，但还需深入研究。 2．2 多价核酸疫苗 无论是同种多价核酸疫苗如HBV—HCV DNA疫苗，还是异种多价核酸疫苗如HBV—HIV DNA疫苗 ，都能在大动物水平上产生针对不同病毒的较高滴度抗体，但效 价不如蛋白疫苗高12 ；同时还可诱导以CTL为主、，I1h1为辅的细 胞免疫。这对扩大免疫范围、减少免疫次数、发展多价DNA疫 苗，具有良好的研究和应用前景。由于质粒DNA可在体内长期 稳定地表达抗原蛋白，所以用这种将多病毒抗原构建在一个质 粒中的嵌合载体技术来研制多效价疫苗，有着巨大的经济和社 会效益。但它也有不足，由于HBV DNA疫苗的实验结果多来自 动物，用于人体的安全性(注射DNA疫苗的安全性和潜在对感 染肝细胞强烈的细胞毒反应)和有效性需要进一步深入研究。此 外，DNA免疫经肌肉注射所需的DNA量大， 免疫注射技术要求 严格。由于真核质粒载体刺激产生抗一HBs效应稍次于逆转录病 毒载体，但致癌性小，所以多作为疫苗载体的首选1221。在细菌免疫 刺激物CpG基序存在的前提下，DNA也可以作为自己的佐剂 ， 同样可以提高免疫原性。 上述两类疫苗中，对蛋白质疫苗的研究比较深入， 应用较 广， 目前疫苗的构成愈来愈向大分子—— 完全乙肝表面抗原发 展，随着剂量的合理加大(>20 g)、附加佐剂(质粒DNA、CpG、 中药等)，抗原性会逐渐增加，同时提升血清转化率(提示保护性 免疫)；如果辅以抗病毒疗法综合性治疗慢性乙肝患者，会取得 良好的效果 | 
发表于 2006-4-14 10:20
