HBV基因型研究

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乙肝病毒基因分型比血清亚型更能准确地反映原型病毒株之间的自然异质性，HBV基因分型方法有多种，以全
基因测序为唯一参比标准。HBV基因型呈地理区域性分布，不同基因型致病性不同，因此，它对于HBV的基础研
究、分子流行病学调查、临床诊治过程中出现的基因变异、对抗病毒治疗反应和病情预后评估均有重要意义， 目前
HBV已分为A～H 8种基因型。本文对乙肝病毒基因型研究进展及临床意义作一综述。
1 乙肝病毒基因型的发现和发展
乙型肝炎病毒感染在世界各地均有不同程度的流行，但地区差异非常明显⋯1。国家间和国内地区间流行程度的
差异，除与卫生状况、生活习惯、人体免疫遗传特征等因素明显相关外，与病毒本身生物学特性(基因型、血清亚
型、基因变异等)也有关。

1988年Okamoto等L2j发现：血清亚型的区分并不能真正反映HBV基因组的差异，由此规
定HBVDNA核苷酸序列异质性≥8％ 则为不同种基因型，而同一基因型的HBV核苷酸序列异质性≤5．6％ ，因而将
HBV分为A．D4种基因型。1994年Norder[3 J发现了E、F两种基因型，且用s基因分型替代全基因测序，简化了分
型方法。2000年，Stuyyer等L4 J发现了第七种基因型G。2002年，Arauz．Ruiz等L5 J通过全基因序列分析又发现了H
型HBV，脱胎于F型HBV。同年，Kao等L6j在研究日本献血者B、c型HBV血清时发现存在混合型感染，考虑可能
是重叠感染或基因型之间部分转换而来。总之。HBV基因型分型标准的依据是全基因序列同源性>92％ ，或S某因序列同源性≥96％。随着HBV基因分型的广泛开展，新的基因型、基因亚型会逐渐被发现，基因分型方法逐渐简化、
准确，便于广泛应用，基因型与临床的关系日趋明朗。

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2 HBV 分型的方法

2．1 HBV的全基因测序
Okamoto在对亚型adw2的HBVDNA测序时发现。其核苷酸的异质性为8．3％ 9．3％ ，再对18例HBVDNA进
行两两比较分析，根据异质性≥8％、同源性<92％ ，将其分为A、B、C、D 4种基因型，从而初步建立了基因分型体系。该方法直接、可靠，但繁琐、费时、费用高，不适
宜广泛开展。

2．2 S基因序列测定
Norder用S基因序列测定分型替代全基因序列分析，根据S基因核苷酸异质性≥4％分型，除证实了Okamoto的A～D 4种基因型外，还发现了E和F两种基因型。初步简化了HBV的基因分型方法。仍存在繁琐、费用高等缺点，难以广泛开展。

2．3 PCR—RFLP法
Lindh等【’j对不同基因型HBVS基因的特异酶切位点进行分析，设计使用限制性内切酶TrpSOa I和Hin fl，使S基因PCR产物产生不同长度的酶切片段而成功分型。Mizoka—mi等 ]用这种方法发现并确认了基因型特异性酶切位点区域，这些特异性内切酶为Hph I (F型)，Nei I (D型)、Alw I (除C型外)、Ear I (除B型外)和Nia IV (A型)，A型只有一个NiaⅣ 酶切位点，而D型有两个酶切位点。
用这5种限制性内切酶可区分A～F6种基因型，酶切图谱简明直观。由于前s基因是HBV基因变异最大的区域，而每一种基因型的变异是有限的，提示前s区最适合基因分型。随后Lindh等又建立了前S基因PCR．RFLP的分型方法。经与S基因PCR．RFLP比较，后者不能分型的标本用前S基因PCR．RFLP法可以明确分型，表明这种方法简明，而且更加完善。但目前建立的PCR RFLP分型方法都不能鉴定100％的标本，而且此种分型法所需时问长，步骤多，且遇到混合感染或酶切不完全，就会出现复杂带型，影响
分型结果的判断。

而杨洁等[ 建立的Muhiplex PCR分型方法，在一个PCR反应体系中含有多对引物的PCR。方法简便，准确率高，理论上准确率应为100％ 。

2．4 HBV基因型特异性表位单克隆抗体的ELISA
u da等[1ol用前s区基因型特异性表位的单克隆抗体，用辣根过氧化酶进行标记，证明该法分型与s基因测序分型结果完全一致，该法未能分型的标本是因为不同基因型混合感染或基因型特异性表位点突变之故，因此适用于大规模的流行病学调查。方法虽简单，但要建立一套单克隆抗体则较为困难。

2．5 HBV基因型特异性线型探针检测法
VanGeyt等依A F基因型的保守序列设计了18种型特异性探针与HBVS基因的PCR产物进行杂交实现分型。

2．6 HBV基因型特异性引物PCR
Naito等[ 1]依A—F基因型中特异性保守序列设计引物并进行套式PCR。首先用共用引物扩增S开放读码区，再加入型特异性引物的混合物进行第二轮PCR，这样扩增出不同长度的核苷酸片段，从而达到分型的目的。

2．7 微板核酸分子杂交一E LlSA
该方法将基因扩增、核酸分子杂交和酶联免疫显色三种诊断技术融为一体，发挥了核酸分子杂交技术特异性高，PCR检测技术灵敏度高和酶联显色检测方便的优点，将待测核酸经PCR扩增后，分别与各型探针同时杂交，然后通过酶联免疫显色判定结果。该方法杂交时间短、分型准确可靠、操作简单、自动化程度高，可大规模进行HBV基因分型 。

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3 HBV基因型流行病学分布
众多研究表明：HBV基因型呈一定的地理区域分布，A型主要分布于欧洲北部、西部及非洲撒哈拉沙漠地带；B、c型主要分布于远东东部，亚洲南部；D型分布最广泛，是地中海地区和近东的优势基因型，也发现于亚洲少数地区；E型主要分布于非洲撒哈拉沙漠地带；F型主要分布于美国；G型发现于法国和美国【 ；H型已在尼加拉瓜、墨西哥、美国的加里弗尼亚等地发现L5 J。

在我国北方以c型为主，南方以B型为主，D型多见于少数民族地区，如西藏、新疆L】引。A、F型偶有发现，无E型。

目前认为，
不同地区优势基因型反映了HBV自然感染史发生的变异特点，是病毒变异后进化的结果。

4 乙肝基因分型的临床意义
4．1 HBV的基因型与血清亚型的关系
HBV血清亚型并不能真正反映HBV的自然异质性，它们的关系为：A型(adw2，ayw1)，B型(adw2，ayw1)，
C型(adrq ，adrq一，adw2)， D 型(ayw2，ayw3)， E(ayW4)，F型(adw4q一)。HBV血清亚型是由病毒外膜主蛋白上的一些氨基酸残基决定的。从基因密码到蛋白质要经过转录和翻译，再经过修饰加工形成功能蛋白质，所以蛋白质的种类数目多于基因的种类和数目，基因型能更好地反映HBV核苷酸的自然异质性。

4．2 HBV基因型与病毒复制及变异的关系
Kobayashi[14—16]研究报道，c型HBV的HBeAg阳性率高于B型和A型，而B型HBeAg阴性率高于c型，提示c
型HBV复制较活跃，易形成持续病毒血症，不易发生e系统血清转换。日本学者Orito等和我国台湾学者Kao等在研究B、c两型HBV时，发现c型HBV血清DNA水平显著高于B型。法国Grandjacques[n]在检测HBV基因型及前c／C区变异与病情严重程度及病毒复制水平时，发现D型HBV前c区ntl896位终止密码子变异频率高于A型，而其他变异与基因型无关。而Kao等【 j在研究HBV基因型与a一干扰素应答关系时发现，C型HBV血清DNA水平高于B型，同时c型BCP变异发生率显著高于B型，对干扰素应答率低于B型。Kikuchi等发现A型HBV在成人中急性感染后易形成持续病毒血症，且不易自愈。可见，HBV基因型与病毒复制变异存在相关性。A、F型HBV毒株nt1858位为碱基C，能与ntl896位碱基G形成稳定的茎袢结构，能阻止ntl896位G— A的突变，而B、C、D、E型的HBVDNA的ntl858位为T，易发生ntl896位终止密码子变异，可见，前c区ntl858位点碱基C或T呈现基因型依赖性，提示HBVDNAntl896变异受不同基因型筛选。此外，近年来研究还发现，疫苗的逃避变异的发生与E型关系密切。

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4．3 HBV基因型别与疾病转归的关系

众多研究显示：基因型是影响HBV感染后果的主要决定因素之一。不同的基因型有致病性差异。HBV急性感染后，A型易成为慢性持续感染，肝癌发生率也与基因型、年龄有关。Kao等【2o]报道我国台湾地区以B、c型为优势株，50岁以上HCC和LC患者中以C型为优势基因型，而50岁以下以B型为主，提示C型与严重肝病有关，而B型似乎与年轻人肝癌有关。

Tsubota等【 报道26例LC患者中，B型19例中有4例为HCC，C型7例中有5例为HCC。经Logistic回归分析发现，年龄是独立危险因素(但当年龄<45岁时，基因型是独立危险因素)，且发现B型HCC对
经皮肝动脉栓塞治疗反应好于c型。Chan等L2 J报道c型患者炎症坏死指数分值高于B型。日本冲绳地区是乙型肝炎高发区，但因肝病而死亡的比例却最低。Sakugawa等L2 j在研究该地区HBV时发现，B型是该地区优势基因型，提示B型预后良好，与先前报道一致。Friedt等[24j发现，在9例暴发型肝炎的婴儿中有8例为D型，而唯一幸存的婴儿发生了D— A型转移。Thakur等[25 J研究发现，印度以A、D两型为主，D型与严重肝病及年轻人肝癌有关。

总之，HBV基因型与临床表现、预后、治疗应答均有一定关系，提示不同基因型具有不同的致病性，在以B、C为优势为地区，C型具有较强的致病能力，预后差。在以A、D为优势的地区，D型具有较强的致病性，肝病严重，预后不良。近年来乙肝基因型与抗病毒药物疗效的研究，提示不同基因型间的药物敏感性也有差异。Kao等还比较了B、C型乙肝患者对干扰素ct-2b的应答反应，结论为年轻、B基因型感染者可能预示对干扰素有较好的应答。wai等126 J也认为B型乙肝病人血清HBeAg对干扰素的应答优于C型。
张欣欣等【27 J对35例HBeAg阴性的乙肝患者进行干扰素治疗中发现，A型患者比其它基因型的患者对干扰素有更高的应答率，且不依赖先前ALT水平和干扰素的剂量。Aku．ta等【2。J对213名基因型为A、B、C的慢性乙肝病人用拉米夫定治疗1年以上来判定YMDD基序突变出现的累积率。发现乙肝病人中拉米夫定的耐药不依赖于基因型，而更依赖于B型的亚型，还发现在B型和C型的乙肝病人对拉米夫定耐药与HBeAg状态一致性存在差异。Hannoun等[29]研究认为混合基因型乙肝患者与单一基因型相比对干扰素的
应答没有明显区别。

5 HBV基因分型研究存在的问题及展望
各地区检测方法不同，势必影响客观结果，所以尚有待于寻找更加简便易行、高效准确、费用较低的分型方法。基因芯片技术符合这一要求，值得深人研究。不同基因型有不同致病性，致病机制尚待研究；基因型有助于临床病情评估，治疗药物的选择和预后判定，与临床的关系还应进一步观察研究。基因型的改变提示在HBV感染中，还有许多未知的过程有待于进一步研究。基因分型的研究为乙肝病毒变异的研究、发病机制的探讨和分子流行病学研究提供了有力工具。它还可用于追踪乙型肝炎暴发时的传染
这是亚型分析所不能做到的。能否通过改变基因型防治肝炎，是个值得思考和研究的问题，为难以根治的乙型肝炎提供一个新的治疗方向。

希特勒

路过,顶下.

dsjc001

俺是c型，郁闷

张小军

我不知道是什么、

xiaozou

关于乙肝病毒基因型，本人曾写给一篇综述，在2004年发表。

乙型肝炎病毒基因型与临床关系的研究进展

  [摘要] 乙型肝炎病毒基因型的研究是当前国内外乙型肝炎研究的热点，目前分为A－H 8个基因型，乙型肝炎病毒基因型与乙型肝炎的流行病学分布、病毒变异、病毒复制与清除、抗病毒治疗疗效及疾病进展、预后评估均存在一定的相关性。

[关键词]： 肝炎病毒，乙型；基因型；临床

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus, HBV）为一双链DNA病毒，属嗜肝DNA病毒。HBV感染是一个全球性的健康问题，目前全球大约有3.5亿HBV慢性感染者，仅中国就有1.2亿HBV携带者。HBV基因组又称HBV DNA，约由3200个碱基对组成。近年来，随着分子生物学技术的迅猛发展和对HBV认识的不断深入，国内外许多学者对HBV基因分型开展了多方面的研究，为此，本文将近年来的研究进展作一综述。

1. HBV基因型的建立和发展

1988年，Okamoto等^[1]通过对18株不同血清亚型的HBV DNA全序列检测、两两比较分析，根据HBV DNA基因序列异源性≥8％定为不同的基因型，而将HBV 分为A、B、C、D四种基因型，从而初步建立了基因分型体系。1994年，Norder等^[2]对扩增了的6株HBV DNA测序后又发现了两种新的基因型：E型和F型；2000年，Stuyver等^[3]发现了第七种基因型：G型；2002年，Arauz-Ruiz等^[4]等通过全基因序列分析又发现了H型HBV。至此，目前已发现的HBV基因型共有A－ H 8种。基于乙肝病毒表面抗原亚型的复杂性和HBV基因分型的广泛开展，可能会有新的基因型逐渐被发现。

2.   HBV基因分型的方法

目前，可用于HBV基因分型的方法有：(1) 全基因序列测定分析；(2) S基因序列测定分析 ；(3) 聚合酶链反应－限制性片断长度多态性分析（PCR-RFLP）； (4) 基因型特异性单克隆抗体的ELISA；(5)基因型特异性线性探针检测法；(6)基因型特异性引物 PCR法（即巢式PCR法）；(7)微板核酸分子杂交－ELISA。其中全基因序列测定分析方法为金标准，但繁琐、费时，成本高，难以推广，其他方法相对简单，但也均有一定的缺点。目前比较常用的是：PCR-RFLP法和巢式PCR法。

3.   HBV基因型的流行病学分布特点

众多研究表明^[3~5]，HBV基因型分布呈一定的地理区域性：A型主要分布于北欧、西欧、美国及中；B、C型主要分布于东亚、东南亚；D型分布最广，但以地中海地区、中东、南亚为主；E型主要分布于中非；F型主要分布于美洲；G型发现于美国、法国；H型已在尼加拉瓜、墨西哥、和美国的加利福尼亚等地区发现。在我国，以B型和C型为优势基因型，其中北方以C型为主，南方以B型为主，D型多分布于少数民族地区，如新疆、宁夏、西藏、。A、F型偶有发现，尚未见E、G、H型。目前认为，这种地域性分布反映了HBV感染史中发生的变异特点，是病毒变异后进化的结果。

xiaozou

继续。。。。。。

4. HBV基因型与病毒变异

（1）点1896变异  nt1896 G→A是前C区最常见的点突变，该变异使前C区第28位核苷酸密码子由色氨酸（TGG）变为终止密码子（TAG），从而使前C区启动的编码停止,HBeAg合成终止，病毒无法表达HBeAg，致使血清中HBeAg呈阴性。A型、F型和少数C型病毒株的nt1858位为C，能与nt1896位的G形成稳定的发夹形的茎袢结构，此结构能阻止nt1896 G→A的碱基突变；而B、D、E和大部分C型的nt1858位为T,不能与nt1896位的G形成稳定的茎袢结构，因而易发生A1896突变^[5]。这就部分解释了为什么亚洲东部（以B、C型为主）、南欧（以D型为主）发生突变率高，而北欧和北美（以A型为优势株）较少发生。Sumi等^[6]研究表明：在HBeAg(+)患者中，B基因型A1896突变率显著高于C型者。

(2) C基因启动子（CP）变异 CP最常见的变异是nt1762位的A→T和nt1764位的G→A变异，此变异极大地降低了C编码区的转录，可使HBeAg缺失，此两点变异为基本核心启动子（BCP）的热点变异，称为“双变异”。Orito等^[7]通过对50例B型或C型的慢性乙肝病人研究，发现BCP区1762/1764双变异在基因型C中发生的频率明显高于B型（58％比16％）。Kao等^[8]在研究BCP变异增加患HCC的危险性时也发现C基因型1762/1764变异出现的频率显著高于B型（52％比29％）。香港学者Yuen等^[9]研究报道：B基因型多与前C区变异相关而C型与CP变异关系密切，Sumi等 ^[6]等也报道了相同的结果。

（3）前S区变异 此变异可使部分HBV感染者出现血清HBsAg呈阴性而HBV呈阳性。Huy等^[10]研究了12个国家387例HBV DNA(+)病例，结果发现前S区（前S₁区和前₂区）变异，在B基因型和C基因型中分别为25％和24.5％，比其他基因型多见。

5.HBV基因型与病毒复制、清除

Sanchez-Tapias等^[11]通过随访、研究258例HBV感染者的基因型，发现A、D型为西班牙西部的优势株，A型的HBV DNA清除率高于D型和F型，同时，A型的HBsAg清除率也比D型高。Lee等^[12]研究了台湾南部265例HBV感染者，发现C型HBV感染者HBeAg阳性率高于B型，香港的Yuen等^[9]对343名HBV感染者的研究结果表明：B型HBV感染者HBeAg血清转换平均比C型早9年。Furusyo等^[13]研究日本福冈和冲绳地区158例HBV感染者后报道：在观察研究的早期，C型HBeAg阳性率明显高于B型，而B型每年HBeAg的自然清除率高于C型。Nakayoshi等^[14]对慢性乙肝患者进行随访，在初始的2年里，13例B型中有8例（61.5%）HBeAg被清除，而在14例C型中只有1例（7.1%）出现，提示B型感染者的血清HBeAg清除率较C型者显著常见且较早发生。

上述这些结果表明：C型HBV的HBeAg阳性率高于B型，而B型HBeAg阴性率高于C型，提示C型HBV复制较活跃，易形成持续病毒血症，不易发生e系统血清转换而B型血清转换发生快，免疫清除HBV较C型早。

总之，不同的基因型可能导致HBV病毒不同的的复制、清除率。

6. HBV基因型与疾病谱、疾病进展的关系

人类感染HBV基因型的不同类型，可能与疾病谱及疾病的进展有一定的相关性。Scanchez-Tapias等^[11]在研究HBV基因对西班牙西部慢性乙肝患者的影响时发现：患者感染不同的HBV基因型（A、D、F），会造成不同的长期后果，且在致死性相关肝病中，F型比A、D型更常见。Joh等^[15]研究分析发现：在7例暴发性肝炎中，基因型的分配为：A型1例、B型1例、C型4例、D型1例，比较 25例急性自限性乙型肝炎，A型的临床过程比C型者长。Hsia等^[16]研究美国和加拿大HCC患者时发现，在17例HBV DNA阳性（HBsAg阴性）的HCC患者中，C型为优势基因型，占11例（64％）。

在以B、C基因型为优势基因型的东亚、东南亚，众多的研究报到也表明:基因型的不同可引起不同的疾病谱和疾病进展。日本学者Imamura等^[17]比较了61例急性乙肝（包括45例急性自限性乙肝和16例急性爆发性乙肝）和531例慢性乙肝，发现B基因型在急性肝炎组中的比例明显高于慢性肝炎组（39.3％比11.7％），而急性爆发性者又显著多于急性自限性者（62.5％比31.1％）。这些结果提示B基因型较其他基因型更易导致急性严重的肝损害。Sumi等^[6]研究报到：在高度纤维化和HCC两组病人中，感染HBV B型者的平均年龄显著大于C型者，经病理组织切片诊断的慢性肝病的病人中，B型患高度纤维化的比例明显小于C型者。香港学者Chan等^[18]通过对146例HBeAg阳性的慢性乙肝病人平均随访32个月，发现6名HCC患者均为HBV C型，在血清HBeAg阳性时期，C型疾病的活动性重于B型。另外，Nakayoshi等^[14]通过对35例B型和37例C型慢性乙肝患者随访后对照研究发现，在35例B型中有4例（11.4%）发展成肝硬化而37例C型中有12例（32.4%）发展成肝硬化（且包括2名HCC患者）。多因素分析显示，HBV基因型的不同明显影响肝硬化的形成。在肝硬化的形成过程中，B型较少发生。因此，HBV基因型可影响HBV相关慢性肝病的进展。

7.   HBV基因型与抗病毒治疗治疗

（1）干扰素治疗  目前，干扰素是公认的治疗HBV感染的首选药之一。感染不同的基因型对干扰素治疗的应答可能会有所不同，Kao等^[19]对58例乙肝患者给予α-2b干扰素治疗24周，如果以治疗后48周血清ALT回复恢复正常、HBeAg清除及HBV DNA转阴作为有效指标，B、C两型的有效率分别为41.%和15％，若以血清ALT恢复正常为有效标准，B、C两型的有效率分别为50%和17%，这说明，对干扰素的应答率B型高于C型。Wai等^[20]研究109例HBeAg阳性的慢性乙肝病人，对其中的73例（B型31例，C型42例）应用α-干扰素治疗，结果发现，有12例B型和7例C型产生抗病毒反应，B基因型的应答率高于C型。通过多变量分析，基因型、治疗前ALT水平和HBV DNA水平与干扰素应答之间的关系发现B基因型、治疗前低HBV DNA水平和高ALT水平与干扰素高应答率有关，因而，他们认为，与C基因型相比，B型有较高的干扰素诱导的HBeAg清除率。

(2)拉米夫定治疗  拉米夫定是目前另一种抗HBV感染的首选药，它是一种核苷类似物，具有较强的抑制HBV复制的作用。Kao等^[21]对31例HBeAg阳性的慢性乙肝患者使用拉米夫定治疗，B、C型的HBeAg血清转换率分别为23%和11%，耐药发生率分别为15%和22%，这提示，B型对拉米夫定的病毒学应答率高于C型。以色列学者Ben-Ariz等^[22]研究报道在因出现拉米夫定抵抗而再发HBV感染的肝移植受体者中,D型HBV感染者比A型者多见。Suzuki等^[23]对日本234名慢性HBV感染者使用拉米夫定治疗12个月以上，结果发现B基因型的ALT恢复正常率和HBV-DNA转阴率高于C基因型。目前众多临床研究发现，长期使用拉米夫定可引起HBV耐药或病毒变异，常见的变异为YMDD变异（包括YIDD和YVDD变异）。Zollner等^[24]研究了41例（26例A基因型和15例D基因型）出现拉米夫定耐药的乙肝患者的病毒学特点，发现出现YIDD变异者，D型中有67％，A型中有19％，而出现YVDD变异者，A型有81％，D型有33％。提示不同的基因型可能对YMDD变异产生不同的影响。

HBV基因型与抗病毒药物治疗应答率之间的关系可能还需要进一步广泛、深入的研究。

12252003

我全部保存下来，晚上好好看