乙型肝炎病毒DNA对肾小管上皮细胞凋亡的影响

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乙型肝炎病毒DNA对肾小管上皮细胞凋亡的影响 邓存良 宋新文 陈枫 盛云建 王明勇 2004-12-29 16:45:40　中华肝脏病杂志,2004年，第12卷，第12期，752-753页 [摘要]

Influence of HBV DNA positive patient serum on apoptosis of renal tubular epithelial cells in vitro. DENG Cun-liang, SONG Xin-wen, CHEN Feng, SHENG Yun-jian, WANG Ming-yong. 【Key words】 Hepatitis B virus; Epithelial cells; Apoptosis; Renal tubular 【First author''s address】 Department of Infectious Diseases, Hospital of Luzhou Medical College, Luzhou 646000, China

　　乙型肝炎病毒（HBV）感染机体不仅引起肝脏功能和结构的改变，还可引起肝外多种脏器损伤。其中，HBV相关性肾炎最受关注，其发病机制尚不清楚。近来研究发现肾小管间质病变较肾小球病变在肾脏病进展中意义更为重要，而肾小管上皮细胞凋亡与增殖之间的不平衡可能是导致肾小管萎缩和肾功能恶化的重要机制之一。为此，我们以体外培养的正常人肾小管上皮细胞为对象，观察慢性乙型肝炎患者HBV DNA阳性血清对它的凋亡及Fas表达率的影响，以探讨HBV致肾小管上皮细胞损伤在肾脏疾病中的作用。 　　一、材料与方法 　　1. 血清和试剂：慢性乙型肝炎轻度患者血清来自本科2003年住院患者，诊断均符合2000年全国传染病和寄生虫病学学术会议修订的病毒性肝炎的诊断标准[1]，排除甲、丙、丁、戊型肝炎。HBV DNA经荧光定量聚合酶链反应（FQ-PCR）法检测，分为HBV DNA阴性组20例和HBV DNA阳性组24例。两组在性别、年龄、肝功能等方面无统计学差异。无菌采集血清，于-80℃冻存，用前经56℃ 30min灭活补体。FQ-PCR检测试剂盒购自上海复星医学科技发展有限公司，Annexin V凋亡检测试剂盒购自美国Bio vision公司，CD95检测试剂盒购自苏州基因公司。 　　2. HBV DNA检测：血清标本、试剂盒内阳性与阴性对照各取100μl，分别加入100μl核酸提取液A，振荡10s混匀，13000r/min离心10min，弃上清液；分别加25μl核酸提取液B于沉淀中，振荡10s，100℃沸水浴10min，13000r/min离心2min。按样品数44取PCR缓冲液44×18μl、MgCl2 44×3μl、HBV荧光探针44×3μl 、Taq酶44×2μl混于离心管中，旋涡振荡器上振荡10s混匀，低速离心数秒，按每管26μl分装。将样品处理上清液和定量校准品1～4号各4μl分别加入反应管中，混匀后置于自动FQ-PCR仪（美国LightCyceler公司产品）上，立即进行PCR扩增反应。标准：≤4.00×103拷贝/ml为阴性，＞4.00×103拷贝/ml为阳性。 　　3. 细胞培养：HK-2为正常人近端肾小管上皮细胞系，购自美国ATCC公司。用含10%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃、体积分数5% CO2的条件下培养，细胞贴壁生长，每2～4d传代1次。 　　4. 对HK-2凋亡的影响：将HK-2传代于24孔培养板，分别加HBV DNA阴性及阳性血清50μl，继续培养72h，0.25%胰酶消化收集细胞，加Annexin V及碘化丙啶各5μl，室温避光反应5min，上流式细胞仪检测细胞凋亡情况。 　　5. 对HK-2 Fas表达的影响：将HK-2传代于24孔培养板，分别加HBV DNA阴性及阳性血清50μl，继续培养72h后，0.25%胰酶消化收集细胞，加CD95抗体10μl，室温避光反应20min，上流式细胞仪检测细胞Fas表达率。 　　6. 统计学处理：所有数据以x-±s表示，用SPSS10.0软件进行t检验和直线相关分析。 　　二、结果 　　1. HBV DNA定量检测结果：慢性乙型肝炎轻度患者血清经FQ-PCR检测，HBV DNA阴性血清20例，HBV DNA阳性血清24例，HBV DNA定量阳性组最小值为9.36×103拷贝/ml，最大值为1.57×109拷贝/ml。 　　2. HBV DNA阳性血清对HK-2凋亡的影响：HBV DNA阳性血清组HK-2的凋亡细胞比例为（19.01±5.85）%，HBV DNA阴性血清组HK-2的凋亡细胞比例为（8.12±2.80）%，前者明显高于后者，两组间差异有统计学意义（t＝5.589，P<0.01）。凋亡检测结果见图1、图2。 　　3. HBV DNA阳性血清对HK-2 Fas表达的影响：HBV DNA阳性血清组HK-2的Fas表达率为（18.07±5.46）%，HBV DNA阴性血清组HK-2的Fas表达率为（6.92±3.99）%，前者明显高于后者，两组间差异有统计学意义（t＝4.036，P<0.01）， Fas检测结果见图3、图4。 　　4. 相关分析：HBV DNA阳性血清组HK-2的凋亡比例与HBV DNA定量呈明显正相关（r＝0.657），见图5。HK-2的Fas表达率与细胞凋亡比例也呈明显正相关（r＝0.702）。 　　三、讨论 　　研究显示HBV DNA阳性血清可诱导体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）凋亡，细胞Fas表达率明显增高，且细胞凋亡比例与HBV　DNA定量及Fas表达率呈正相关。 　　Fas/Fas配体系统介导细胞凋亡在多种疾病发生、慢性化等过程中产生病理作用[2，3]。在慢性肾脏疾病，肾小管上皮细胞Fas表达上调，导致肾小管上皮细胞凋亡和丧失，肾小管萎缩，进而引起肾间质纤维化[4]。研究表明急性肾移植损伤，肾小管上皮细胞活化后表达Fas、Fas配体，相互作用诱导凋亡导致肾小管上皮细胞自我损伤，睾丸激素可诱导体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）Fas表达上调，Fas配体表达增加，进而诱导细胞凋亡[5，6]。近来Khan等[7]用携带鼠Fas的真核质粒转染人肾小管上皮细胞，发现高表达Fas的细胞可经非JNK依赖途径促进细胞凋亡，而低表达Fas的细胞则促进JNK活性增加，而不诱导凋亡。提示Fas在慢性炎症或肾小管上皮细胞损伤过程中可能发挥重要作用。 　　慢性乙型肝炎轻度患者HBV DNA阳性血清可诱导培养的人肾小管上皮细胞发生凋亡，且细胞凋亡比例与HBV DNA定量、Fas表达成正相关，提示HBV感染血清可诱导肾小管上皮细胞凋亡，凋亡程度与HBV复制水平有关，途径可能是经Fas/Fas配体介导的。这种细胞凋亡具体原因及其凋亡后致肾小管萎缩，进而引起肾间质纤维化是否为HBV相关性肾炎发病机制之一，尚需进一步研究。

参 考 文 献

[1]中华医学会传染病与寄生虫病学分会、肝脏病学分会. 病毒性肝炎防治方案. 中华肝脏病杂志, 2000, 8: 324-329. [2]Lieberthal W, Levine JS. Mechanisms of apoptosis and its potential role in renal tubular epithelial cell injury. Am J Physiol, 1996, 271(3 Pt 2): F477-488. [3]李玲, 顾长海, 李欣, 等. HBV阳性血清诱导人外周血单个核细胞凋亡的检测及意义.细胞与分子免疫学杂志，2001，17：267-268. [4]Schelling JR, Nkemere N, Kopp JB, et al. Fas-dependent fratricidal apoptosis is a mechanism of tubular epithelial cell deletion in chronic renal failure. Lab Invest, 1998, 78: 813-824. [5]Du C, Guan Q, Yin Z, et al. Renal tubular epithelial cell apoptosis by Fas-FasL-dependent self-injury can augment renal allograft injury. Transplant Proc, 2003, 35: 2481-2482. [6]Verzola D, Gandolfo MT, Salvatore F, et al. Testosterone promotes apoptotic damage in human renal tubular cells. Kidney Int, 2004, 65: 1252-1261. [7]Khan S, Koepke A, Jarad G, et al. Apoptosis and JNK activation are differentially regulated by Fas expression level in renal tubular epithelial cells. Kidney Int, 2001, 60: 65-76.

（收稿日期：2004-07-02） （本文编辑：朱红梅）

基金项目：四川省科委资助项目（01SY051-29）；四川省卫生厅资助项目（000112）；四川省重点学科建设项目（SZD0421）

作者单位：646000 泸州医学院附属医院感染科