RNA干扰抗肝炎病毒治疗的希望与发展方向

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RNA干扰抗肝炎病毒治疗的希望与发展方向魏来
2004-9-24 10:55:06　中华肝脏病杂志2004年第12卷第9期555页[摘要]

　　RNA干扰（RNAi）是由小双链RNA有效地作用于同源RNA序列，经细胞内核酸酶作用使同源序列降解的过程。虽然最初的研究是观察其对细胞基因的下调作用，近来的一些研究表明RNAi在抗肝炎病毒等人类和动物病毒中也同样有效，所以RNAi有可能发展成为一个新的抗肝炎病毒治疗的方法。
　　1. RNAi的载体与给药方法：在RNAi抗肝炎病毒的研究中，所用RNAi包括合成的小干扰RNA（siRNAs）和质粒依赖的siRNA表达体系。两种方法均较为有效，前者仅能获得瞬时抑制，后者的抑制作用则较为持久。两者距临床应用都还有一定距离。
　　2. 抗丙型肝炎病毒：RNAi抗肝炎病毒最早的成功研究是抗丙型肝炎病毒（HCV）。HCV基因组的5′端非编码区（5′UTR）高度保守，调节病毒的复制与蛋白表达，HCV非结构基因（NS）5b编码的RNA依赖的RNA聚合酶与NS3、NS4a蛋白组成复制酶复合体，以病毒基因组为模板复制出负链RNA，进而复制出新的正链。抗HCV的RNAi都以上面的几个基因区为靶基因。又因为siRNA和靶基因之间的单个碱基错配都会影响RNAi的效率，所以，HCV保守的5′UTR 是RNAi沉寂HCV最理想的靶位。研究RNAi抗HCV的6个研究小组观察了9条siRNA的作用，其中4条以HCV 5′UTR为靶基因，3条以HCV NS5b为靶基因。RNAi抗HCV的研究主要以细胞模型为主，目前研究HCV复制最有效的细胞模型是含有HCV复制子的Huh-7细胞，RNAi在细胞水平抗HCV的研究都以此为模型。以HCV 5′UTR为靶位的siRNA在转染后12、96h分别使HCV复制效率降低5倍和80倍，在转染Huh-7细胞2d后，以HCV NS3为靶位的siRNA可以抑制HCV复制达5.7倍，而针对NS5b的siRNA抑制效率达8.3倍，为干扰素对复制子抑制效率的3倍。若以质粒依赖的siRNA同时表达有意义链和反义链，在转染3d后仍能保持70%的抑制效率。惟一的在体研究以鼠为模型，化学合成与质粒依赖的siRNA对HCV复制抑制效率可分别达到75%和98%。显示了质粒依赖siRNA抗HCV复制应用于临床的巨大潜力。
　　3. 抗乙型肝炎病毒：有7个研究小组分别研究了以乙型肝炎病毒（HBV）表面（S）基因、核心（C）基因、前C基因和X基因为靶位的siRNA作用，抑制效率达42%～78%，鼠模型在体研究中以S基因和C基因为靶位的siRNA可使HBV表面抗原和e抗原降低至1/3。特别是S基因区的siRNA持续抑制达11d，而C基因区siRNA的抑制效率仅持续3～5d。
　　4. 抗丁型肝炎病毒：有限的RNAi抗丁型肝炎病毒（HDV）研究发现，HDV RNA的基因与反基因均对RNAi有抵抗。
　　5. RNAi对干扰素通路的活化：RNAi在抗肝炎病毒作用中的另一个机制是能够活化干扰素通路，非特异地减弱病毒蛋白的合成和RNA降解。更能使2′、5′寡腺苷酸合成酶的活性增高500倍。
　　6. RNAi抗肝炎病毒的潜在意义：在抑制HBV复制研究中最有意义的结果是：RNAi除了有效抑制活跃复制的HBV，还能抑制非活跃复制的HBV，这一点不同于核苷类似物，因此，有可能发展成为与拉米夫定、阿德福韦等核苷类似物作用机制和位点不同的抗HBV药物联合用药。RNAi不能达到对病毒复制的完全抑制，限制了其作为单剂用药的可能性，因此，今后抗肝炎病毒的作用可能定位在与其它药物的联合用药与辅助用药中。但是，与其抗肝炎病毒治疗的应用并不矛盾，因为，抗生素在细菌感染中的应用经验表明，对不同靶点的药物联合作用将显著提高抗微生物的效果。同时，RNAi本身可以通过对多靶位的联合作用进一步提高抑制效率。RNAi发挥作用依赖于与靶序列完全同源，也需要多靶位RNAi联合应用，避免单个RNAi在病毒变异时失去作用。
　　7. 面临的问题：(1)RNAi作用的生物环境：在siRNA取得最显著抑制效率的抗HCV研究中，多以复制子为研究模型。HCV复制子只能在Huh-7细胞中复制，而在别的细胞中则很困难，提示Huh-7细胞中含有其它肝细胞株不存在的元件支持HCV复制（虽然现在还没有发现或认识到这些元件）。同样，含有复制子的Huh-7细胞可能拥有RNAi作用所必需的功能元件，而在正常感染状态下，受HCV感染的人肝细胞是否具有这些必需元件或者HCV将抑制RNAi的作用还需要明确。(2)肝炎病毒的特性：对HBV基因区的选择还未能明确最有效的靶基因区，并且还有一些非特异的抑制作用。因为HBV共价闭合环状DNA位于细胞核中，而RNAi难以进入细胞核，因此，RNAi抗HBV作用不可能从根本上改变现行抗HBV治疗的效果。(3)药物靶向问题：RNAi干扰的给药方式和药物靶向问题还需要充分研究，加以解决。(4)可能出现耐药：RNAi严格遵循碱基互补原则，单个碱基的错配即可显著降低其抑制效率。肝炎病毒中，特别是HCV易于变异，在RNAi不能完全抑制病毒的基础上，单个碱基的变异即可使残留的低负荷病毒很快逃逸RNAi的作用，重新活跃复制。
（收稿日期：2004-07-02）
（本文编辑：朱红梅）
作者单位：100044 北京大学人民医院、北京大学肝病研究所