[转帖]慢性丙型肝炎肝细胞DNA损伤与中药复方保护作用

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慢性丙型肝炎肝细胞DNA损伤与中药复方保护作用 了解丙肝组织中细胞DNA损伤修复程度，探讨丙型肝炎发病机理。方法：以正常大鼠肝脏为正常对照，以四氯化碳慢性肝损伤大鼠肝脏为阳性对照，应用原位末端标记技术（TUNEL）检测了53例慢性丙肝患者治疗及随访半年前后肝穿组织细胞凋亡（106例）。结果：（1）未加末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）者，未见任何阳性着色，正常大鼠肝脏，偶见阳性细胞，散在分布，着色浅淡。四氯化碳损伤肝组织50%以上的肝细胞核阳性。本组107份丙肝组织均为阳性，呈核型着色，弥漫分布；未见浆型。阳性细胞数目，着色深度各组织不一。总体而言，接近四氯化碳损伤肝组织，除肝细胞外，汇管区50%左右淋巴细胞阳性，部分胆管上皮，窦周细胞及窦内淋巴细胞亦阳性。汇管区、小叶内坏死灶阳性细胞密集。阳性细胞中除少数核固缩或空泡变性，多数与阴性细胞未见明显形态学差异.（2）半定量计分显示 TUNEL标记积分同组织炎症活动度、血清ALT呈正相关，同肝纤维化积分无关。（3）清肝冲剂治疗后70.3%（19/27）的组织TUNEL阳性数减少或减弱，积分显著下降。补肾组减少或减弱58.3%（7/12），积分轻度下降.对照组无明显变化。提示清肝冲有显著拮抗DNA损伤作用，补肾次之。结论：（1）如此众多TUNEL阳性细胞虽不可能均代表凋亡肝细胞，但它可能反映肝细胞处于高度的DNA的断裂损伤及其增殖修复状态。同时也提示HCV的感染类似细胞毒剂，可造成肝细胞胆管上皮，窦周细胞淋巴细胞，广泛DNA损伤，这可能是HCV感染易诱发肝癌的原因之一。（2）中药清肝补肾冲剂有拮抗 DNA损伤作用。 DNA损伤是细胞变性坏死、凋亡过程中必经环节之一，细胞凋亡时胞内核酸内切酶活化，后者将DNA链在核小体间连接区切成缺口，使核内DNA断裂成小片断[1]。在组织细胞原位DNA切口可被脱氧核糖核酸转移酶末端标记，因此应用DNA片段原位末端标记技术（TUNEL）可及时发现细胞DNA断裂损伤。本研究以四氯化碳慢性肝损伤组织为对照，应用TUNEL技术研究66例慢性丙肝患者组织DNA的损伤，并观察了中药复方保护作用。 材料与方法 1. 标本来源：本组106例待检丙肝组织切片来自53例慢性丙肝患者中药治疗前后肝穿标本。患者均为甘肃省定西县城关乡长期献血的农民，丙肝病史已5年以上。阳性对照为四氯碳慢性肝损伤大鼠肝脏，正常对照组为正常大鼠肝脏（大鼠肝组织由上海医科大学病理教研室提供）；阴性对照为不加未端转移酶（TdT）空白对照，疾病参比对照为同期收治的18例乙肝患者之肝穿标本。 2. 方法与试剂：肝穿组织10%中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡包埋。切片5μ，未端脱氧核糖酸原位标记试剂盒（Tunel）购自宝灵曼公司，染色方法操作严格按试剂盒说明进行。 3. 阳性分级及积分标准，依据阳性细胞数目及阳性强度分为0～+++级。数目：0未见阳性细胞,+阳性数少于细胞总数30%，++阳性数达总数30-50%，+++阳性数大于总数50%。强度：O 阴性，+弱阳性，++中度，+++强阳性。计分方法：上述等级分别给予0-3分。总积分为上述两项积分乘积。 结 果 1. 实验特异性：未加末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）者，未见任何阳性着色，正常大鼠肝脏，偶见阳性细胞，散在分布，且着色浅淡。四氯化碳损伤肝组织50%以上的肝细胞核阳性，乙肝参比组织及待检丙肝组织有不同程度阳性显色。 2. 不同组织TUNEL标记阳性细胞分布特征：四氯化碳损伤肝组织，50%以上肝细胞核阳性，着色均匀，间见散在深染浆型表达。除肝细胞外，部分胆管上皮、窦周细胞（窦内皮细胞、枯否氏细胞、星状细胞）、淋巴细胞亦阳性。乙肝组织阳性细胞数较少，散在分布，5-15%不等，着色多较浅。本组107份丙肝组织（其中治疗前后配对53对），均为阳性，呈核型着色，弥漫分布；未见浆型。阳性细胞数目，着色深度各组织不一。总体而言，接近四氯化碳损伤肝组织，远较乙肝多，着色深。嗜酸小体强阳性，除肝细胞外，汇管区50%左右淋巴细胞阳性，部分胆管上皮，窦周细胞及窦内淋巴细胞亦阳性。汇管区，小叶内坏死灶阳性细胞密集，其间细胞碎屑亦为阳性。阳性细胞中少数核固缩或空泡变性，多数阳性细胞形态正常，与阴性细胞相比未见显形态差异。 3. 慢性丙肝组织TUNEL阳性细胞积分与组织炎症、纤维化计分关系。TUNEL标记积分同组织活动度、血清ALT相关，高积分组与低积分组相比，上述2项指标具有显著性差异。TUNEL积分高者组织损伤严重，血清ALT水平高（P<0.05），但TUNEL积分同肝纤维化积分无关。 4. 中药复方治疗后TUNEL 阳性细胞的变化：以TUNEL阳性细胞着色深度或细胞数量下降一级为有效，积分下降2分或2份以上者为显效。清肝冲剂治疗组27对肝穿标本TUNEL阳性数显著减少、减弱者19例(70.3%)，上升7例，一例无明显变化。补肾组，12对组织中显著减少减弱者7例（58.3%），上升3例,2例无变化，对照组14对中，下降3例（21.4%）上升4例,未变3例,积分统计表明，清肝组显著下降，P<0.01,补肾组亦下降，但无统计学差异。对照组轻度升高。提示中药两方有拮抗DNA损伤作用，其中清肝冲剂作用显著。 讨 论 原位末端标记技术（ISEL）或TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（TUNEL）的基本原理是DNA聚合酶或末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）能在DNA断裂末端加尾掺入标记的核苷酸[2]，一般认为 TUNEL技术用于检测凋亡细胞较原位末端转录（ISNT）更敏感，特异能区分凋亡与坏死，能将凋亡细胞同抗癌药及放射线损伤造成DNA断裂区分开来。因此，近年来此技术广泛用于细胞凋亡的研究。 本研究发现在四氯化碳损伤的肝组织，50%以上肝细胞核阳性，着色均匀，间见散在深染浆型表达。除肝细胞外，部分胆管上皮，窦周细胞（窦内皮，枯否氏细胞）、淋巴细胞亦阳性。乙肝组织，阳性细胞数较少，散在分布，5-15%不等，着色多较浅。本组丙肝组织均为阳性，呈核型着色，弥漫分布。阳性细胞数目，着色深度各组织不一。但总体而言，接近四氯化碳损伤肝组织，远较乙肝多，着色深。嗜酸小体强阳性。除肝细胞外，汇管区50%左右淋巴细胞阳性，部分胆管上皮，窦周细胞及窦内淋巴细胞亦阳性。在汇管区、小叶内坏死灶阳性细胞密集，其间细胞碎屑亦为阳性。多数阳性细胞形态正常，与阴性细胞未见明显形态差别。半定量积分发现： TUNEL积分同组织活动度、血清ALT相关。高积分组与低积分组相比，上述2项指标具有显著性差异。TUNEL积分高者组织损伤严重，血清ALT水平升高（P<0.05）。 既往研究[3]及本研究发现：在慢性丙肝组织广泛存在 TUNEL标记阳性细胞，其数量远远多于光镜下所见凋亡小体（嗜酸小体），甚至肝组织内部分双核细胞（一般认为这类细胞为肝细胞增殖的表现）亦阳性，对此差异之解释，目前争议较多[4]。①有人认为细胞形态正常的 TUNEL阳性细胞处于凋亡早期，而光镜下所见凋亡小体是整个凋亡过程中最后瞬时变化，由于细胞凋亡发生迅速，形态学无法捕获更多凋亡小体。②TUNEL存在假阳性。广泛存在TUNEL 阳性细胞难以用凋亡来解释，有人发现实验操作中蛋白酶K过度消化可造成断裂。因此TUNEL阳性不能代表凋亡。③由于双核细胞反映肝细胞增殖，细胞分裂，DNA复制时引导链从5'—3'方向连续合成，而随从链从5'—3'方向形成许多不连续的小片段（100-200核苷酸，即冈崎片段）再由DNA连接酶将许多冈崎片段连接为完整随从链；因而在增殖细胞内不排除TdT标记冈崎片段的可能，这可能是双核细胞阳性原因。 根据TUNEL原理及本实验结果，本文认为 如此多TUNEL阳性细胞不可能全部代表凋亡肝细胞，它可能反映肝细胞处于高度的DNA的断裂损伤及其增殖修复状态。①本实验在相同条件下发现大鼠正常肝组织TUNEL阳性数罕见，且着色浅，未加TDT酶者阴性，而四氯化碳损伤肝组织胞核广泛标记，已知四氯化碳为细胞毒剂，可造成DNA损伤。说明实验特异性好。②实验操作时即使不用蛋白酶K消化，亦能检出TUNEL阳性细胞，且与酶消化者无显著差异，排除蛋白酶K造成假阳性之可能。③乙丙型肝炎发病机理不同，一般认为乙肝以坏死主为，而丙肝以凋亡为主，本组病种对照发现，乙肝阳性细胞数明显较丙肝少，多为30%以下。④ TUNEL积分同组织炎症活动度、血清ALT相关（r=0.80）TUNEL广泛阳性组，炎症活动度积分，血清ALT显著高于 TUNEL低标记组。（5）TUNEL阳性细胞亦多见增生后重建的正常肝组织和增生的肝癌组织中[5]。 辛绍杰[3]及本研究均发现，部分气球样变及增殖中双核细胞亦阳性。因此本研究认为如此多 TUNEL标记阳性细胞虽不能意味着细胞必然凋亡，但它反映宿主细胞的确存在DNA的断裂损伤，也反映肝细胞DNA处于高度的损伤修复状态。同时也提示HCV的感染类似细胞毒剂，可造成肝细胞胆管上皮，窦周细胞淋巴细胞，广泛DNA损伤，这可能是HCV感染易诱发肝癌的原因之一。 中药清肝冲剂、补肾冲剂两方治疗后， TUNEL积分明显下降，清肝冲剂尤为显著（P<0.01）而对照组未见下降，反有上升，提示前述清肝肾两方具有减缓DNA损伤，防止肝细胞凋亡作用。 中华肝脏病杂志网络版