氧化苦参碱抗乙型肝炎病毒的体外实验研究

雪绒花

（李继强 陈萦晅 曾民德 陆伦根 邱德凯 茅益民 范竹萍 华静 上海第二医科大学附属仁济医院 上海市消化疾病研究所） 乙型肝炎病毒感染会导致急慢性肝炎、肝硬化甚至肝癌，其携带者较非携带者发生肝癌的相对危险率为217[1]。目前，我国人群中HBV的感染率高达57.6%，其中约1.2亿为慢性HBV携带者，占我国人口的9.8%左右[2]。而临床上较为有效的药物IFN-a，其近期疗效中血清HBeAg和HBV DNA阴转率仅为40%左右，且由于一定的副作用及价格昂贵而使临床应用受限[3]。因此，寻找有效并适合我国国情的抗HBV药物十分必要。研究表明，氧化苦参碱临床治疗慢性乙型肝炎显示了较好的近期疗效[4]，担对其药理机制远不够了解。为此，我们用HepG2-2.2.15细胞为模型，观察氧化苦参碱体外抗HBV活性，并对其作用机理作初步探讨。 材料与方法 一、 药物： 　　苦参素注射液（含氧化苦参碱98%，规格200mg/2ml），宁夏绿谷药业有限公司产品。批号：宁卫药准字（1994）第000029号。IFN-a 2b（商品名：隆化诺，300万单位/支），上海华新生物高技术有限公司产品。批号：（97）卫药试字（苏新宝）S-02号。 二、 细胞培养： 　　HepG2-2.2.15细胞经美国The Mount Sinai Medical Center的Acs教授同意,由卫生部分子病毒重点实验室闻玉梅教授惠赠。用含20%小牛血清、0.03%L-谷氨酰胺、100IU/ml青霉素、100IU/ml链霉素、380μg/ml G418的DMEM液，置于37°C、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养。 三、 药物对HepG2-2.2.15细胞的毒性试验： 　　通过细胞形态学观察，了解药物引起的细胞毒性作用，根据Mosmann等建立的MTT比色分析法[5]判定各孔中存活细胞增殖代谢情况及细胞毒性反应。 四、 药物应用： 　　培养细胞用胰蛋白酶消化成单个细胞接种于6孔培养板（4x104细胞/孔），加入培养液4ml，于5%CO2培养箱中37°C培养48小时后换入不同浓度含药培养液，同时设不含药物对照组；每3天换新鲜含药培养液共4次，换出的细胞上清液-20°C保存待检，并收集细胞提取核心颗粒HBV DNA。 五、 上清液中HBsAg、HBeAg的检测： 　　 　　采用微粒酶免疫（MEIA）测定技术（美国ABBOTT公司）检测。 　　抑制率=（对照组S/N值-药物组S/N值）/对照组S/N值x100%。 六、 细胞内核心颗粒HBV DNA的提取及定量检测： 　　参照文献方法[6]：6孔板干预细胞以PBS洗涤两次，用细胞裂解液（10mM Tris-HCl pH7.9；1mM EDTA；1% NP-40；50mM NaCl；8% 蔗糖）将细胞转移至Eppendorf管中，离心后保留上清，加DNase I、RNase A37°C孵育15分钟后，以EDTA、PEG8000沉淀核心颗粒。然后重悬沉淀，加裂解液（25mM Tris-HCl pH7.5；10mM EDTA；0.1M NaCl；0.5% SDS；1mg/ml 蛋白酶K）孵育过夜后，酚：氯仿：异戊醇抽提，1/10体积3M NaAc和2倍体积冷无水乙醇沉淀DNA，干燥后溶于50ml双蒸水中。应用bDNA信号扩增试验（QUANTIPLEXTM HBV DNA Assay,CHIRON公司）定量检测HBV DNA滴度。最低检测限度为0.7 HBV DNA MEq/ml。 　　测定值以均数±标准差（X±SD）表示。采用SAS软件包的Dunnett￠s T检验进行统计分析，p值<0.05为差异有显著性。 结 果 一、氧化苦参碱的细胞毒性试验： 　　我们检测了药物对2.2.15细胞的毒性作用以消除存活细胞减少引起的HBV DNA水平下降的可能性。结果显示氧化苦参碱在2000mg/ml浓度下，细胞形态学和MTT比色A值比较，实验组和对照组间无明显差异，提示在该浓度范围内其对2.2.15细胞生长无毒性作用。IFN-α 2b在5x104IU/ ml浓度以下未见明显细胞毒性。 二、 氧化苦参碱对HBsAg、HBeAg的抑制效果： 　　根据药物的细胞毒性试验结果初步确定了用药浓度范围。从表1可见，氧化苦参碱对2.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg均有抑制作用，并且随着药物浓度增加，抑制率逐渐增高。氧化苦参碱在2000mg/ml时对HBsAg、HBeAg的抑制率分别达到40.57%、48.27%。在同一浓度下，都表现为对HBeAg的抑制率高于对HBsAg的抑制率。 三、 氧化苦参碱对HBV DNA的抑制效果： 氧化苦参碱浓度为100～2000 ug/ml时，能明显降低2.2.15细胞胞浆核心颗粒HBV DNA水平（P<0.05），并随着浓度增加，其对HBV DNA的抑制作用亦增强。 四、 IFN-α2b的抗HBV效果 IFN-α 2b对HBsAg、HBeAg和合成和分泌及2.2.15细胞胞浆核心颗粒HBV DNA有明显的抑制作用。 讨论 　　HepG2-2.2.15细胞株是通过将克隆双体HBV DNA及抗G418抗性质粒共转染人肝癌细胞系HepG2细胞而建立的[7]，能长期稳定地向培养上清液中分泌HBsAg、HBeAg和完整的Dane颗粒，并能产生大量的病毒复制中间体。虽然用HBV DNA转染细胞与HBV自然感染存在一定的距离，无法反映由于治疗所激活的肝细胞外效应因子如细胞毒T淋巴细胞、HBV特异性抗体的作用，但是仍然不失为体外抗-HBV药物筛选很好的细胞模型。HBsAg、HBeAg为分泌至2.2.15细胞培养上清液中的可溶性蛋白质，间接地反映了病毒复制状况；2.2.15细胞胞浆核心颗粒是HBV的复制复合体[8]，核心颗粒HBV DNA是病毒感染复制最灵敏、最直接的指标,反映了细胞内非整合的复制性HBV DNA的变化情况。为此,本研究观察2.2.15细胞内核心颗粒HBV DNA及分泌的HBV抗原的变化，以判断氧化苦参碱的疗效，同时结合病毒复制周期，大致推断其作用机理。 　　本研究结果发现,氧化苦参碱可明显降低2.2.15细胞胞浆核心颗粒HBV DNA的水平，提示其能抑制HBV DNA的复制。同时氧化苦参碱对细胞培养上清中分泌的HBV抗原亦有较强的抑制作用，尤其是在同一浓度下，都表现出对分泌的HBeAg的抑制率高于对HBsAg的抑制率。HBV基因组有4个开放读码区：S基因区、C基因区、P基因区和X基因区，分别编码不同的抗原产物[9]。它们的基因表达分别由各自独立的启动子调控[10]，HBeAg由3.5kb的前C基因组mRNA编码产生24KDa的多肽，然后转运到内质网和高尔基体并经细胞蛋白酶剪切后形成16KDa的HBeAg，最后分泌到细胞外。HBsAg由S基因区转录产生的2.1kb和2.4kb的mRNA翻译产生，单独或包装成HBV的外壳再分泌到细胞外。因此可能由于氧化苦参碱对S基因区和C基因区启动子的调控能力不同，从而对HBeAg的抑制能力优于对HBsAg的抑制。结合以上结果推测，氧化苦参碱可能直接作用于HBV DNA水平（转录前水平），亦或干扰了包括逆转录酶和抗原在内的蛋白质合成及后加工，所以对HBV DNA及抗原都有较好的抑制作用。 　　我们的研究结果证实IFN-α能抑制转染细胞系HBV的复制，与既往其他研究报告一致，并印证我们此次细胞模型的可靠性。氧化苦参碱能明显抑制HepG2-2.2.15细胞HBV DNA的复制，显著降低细胞培养上清液分泌性的HBsAg、HBeAg，证明其具有直接的抗HBV活性。其他有关研究还提示其还具有免疫调节[11]、抗肝纤维化[12]等作用，并且价格低廉，无明显毒副作用，因而，无论是单独应用，亦或设想与核苷类似物或IFN联合治疗慢性乙型病毒性肝炎，都可能是一种有潜力的药物，值得更深入研究。 　　感谢：上海第二医科大学附属瑞金医院分子病毒室陆志檬教授、张东华技师在HBV DNA定量检测中的帮助。