乙型肝炎病毒基因组结构与功能复杂性的新认识

雪绒花

作者：成 军, 董 菁
摘要


    全世界有乙型肝炎病毒(HBV)感染者3.5亿人. 对于HBV多年的研究已经积累了丰富的资料，但是，我们对于HBV基因组特性的认识远远没有穷尽，事实上还有许多方面需要进行探索. 通过对特定慢性HBV感染者血清中不同的HBV病毒基因克隆序列的比较提出了HBV准种特点，使我们对于HBV基因组结构与功能的复杂性有了更为深入的了解. 野生型病毒之间、野生型病毒与突变型病毒之间、突变型病毒之间的反式调节机制是各种类型的缺陷型HBV存在的重要条件和机制，也是HBV感染引起肝细胞癌(HCC)的重要的分子生物学机制.  外周血中存在羧基末端截短的表面抗原中蛋白(MHBst)的编码基因，使我们对于HBV基因编码的反式激活蛋白的类型有了新的认识. 通过对克隆的HBV DNA全长基因序列的比较，以及与其他地域所流行的HBV DNA序列之间的比较， 发现了新型的开放读码框架(ORF)，如前-X (pre-X) 蛋白的编码基因和前-前-S(per-pre-S)蛋白的编码基因. 长距离精确聚合酶链反应(LA-PCR)技术克隆的HBV DNA全长序列，是我国流行的adr亚型的HBV DNA全基因序列，代表了真正存在的HBV的基因全长序列，在HBV基因结构与功能的研究中，以及在抗HBV治疗疗效应答的研究中具有重要的理论和实际应用价值.


    0   引言
    乙型肝炎病毒(HBV)的感染不仅引起急性和慢性病毒性肝炎，而且与肝硬化(LC)、肝细胞癌(HCC)的发生发展有着十分密切的关系，全世界大约有3.5亿人受到HBV的感染，尽管乙肝疫苗的免疫预防已经取得了相当好的成绩，但是现患HBV感染者的治疗仍因为没有特效药物而步履维艰，在我国绝大多数终末期肝病患者都是由于感染HBV而引起的[1-10]. 关于HBV DNA基因组结构与功能的复杂性，近年来取得了一些新的研究进展，对于HBV DNA基因组的结构与功能的研究，使人们对于HBV存在状态及其防治任务的艰巨性有了更深入的了解[11-18].



    1   乙型肝炎病毒的准种特点
    中国人民解放军第302医院传染病研究所基因治疗研究中心近年来对于乙型肝炎病毒的准种特点进行了系统的研究[19-26]. 关于HBV准种特点的深刻认识也是从一个偶然的机会开始的. 在HBV基因疫苗的研究领域中，国内外的HBV基因疫苗研究，大部分都是研究ayw亚型的HBsAg编码基因的基因疫苗，这是因为ayw是欧美国家的流行株，也由于大部分研究都是从含有ayw亚型的HBV DNA头尾相连的双基因序列的质粒pCP10开始构建基因疫苗的表达载体，而我们国家的流行株是adr、adw亚型，ayw只是在某些地区流行[27-32]. 因此，我们在研究乙型肝炎病毒基因疫苗时，一开始就设想从慢性HBV感染的患者血清中扩增在中国大陆流行的adr、adw亚型的HBsAg的编码基因. 我们在多聚酶链反应(PCR)扩增和TA克隆过程中，从1例患者的血清HBV DNA标本中就得到了30个左右的HBsAg的编码基因克隆. 为了提高工作效率，我们同时对于数个克隆进行测序研究，结果是各个序列之间具有遗传学上的高度相关性，但又不完全相同. 于是我们对于更多的克隆进行序列测定，结果也是如此. 这些基因序列来源于同一个患者，同属于一个基因型和血清型，但是每个克隆之间又存在着差别，为了描述这种差别，我们采用了研究RNA病毒基因序列差别的种群概念，即准种(quasispecies)的概念，来描述HBV DNA存在的状态[33-40]. 所谓乙型肝炎病毒的准种就是指由遗传学上高度相关，个体之间又有微小差别的乙型肝炎病毒组成的种群，群体的构成处于不断变化之中. 准种的概念强调的是遗传学特点高度相关又有不同，同时在自身和外界因素的影响下群体的构成又处于不断变化之中. 从HBsAg编码基因序列的分析得出准种的概念，我们对于HBV DNA其他的结构基因区和调节基因区都进行了系统的分析，得出了一致的结论. 我们对于一个患者的分析结果如此，对于更多的患者的HBV基因序列进行系统分析，都有相同的结论. 因此，准种特点是HBV存在状态的一个普遍的规律.



    乙型肝炎病毒准种特点的发现实属偶然，准种概念的内涵也清楚、简单. 但是，关于HBV存在状态的准种特点认识的意义却非同小可. 将准种的概念引入到HBV的研究领域中，彻底改变了我们对于HBV存在状态的看法，可以说是对HBV存在状态认识的一场革命. 首先，引入准种的概念，我们对于HBV DNA全基因序列的认识就深入一步. 在美国生物工程信息学中心(NCBI)建立的核苷酸序列数据库GenBank中注册的HBV DNA全基因序列，绝大部分都是应用PCR技术进行分段扩增、克隆，然后再进行人工拼接，形成了所谓的HBV DNA全基因序列. 如果从准种特点来说，这些基因序列根本不代表任何真正存在的病毒的基因序列，完全是一种人为拼接序列，是来源于不同的病毒基因组基因片段的嵌合体. 因为1例慢性HBV感染者体内的病毒基因序列千差万别，甚至很难找到2株序列完全相同的病毒，因此，各个基因片段来源于同一个株病毒的几率微乎其微，是完全不可能的. 这样人工拼接的HBV DNA全基因序列代表不了任何真正存在的HBV基因序列，只代表来源于不同病毒基因序列的嵌合体. 第二，引入准种的概念，我们对于抗HBV疗效考核及其对于HBV的影响的研究方法就要做出相应的调整. 在进行抗病毒治疗的临床研究中，我们经常见到研究报道在抗病毒治疗前后，仅克隆少数甚至是单一的HBV DNA片段的序列，进行比较发现不同之后就判定抗病毒治疗对于HBV基因序列的影响，这样的结论是完全靠不住的. 因为慢性HBV感染者体内的不同的HBV之间序列本来就是不同的，即使不进行抗病毒治疗，2个时间点先后取得的HBV基因序列就是不同的，这种差别与抗病毒治疗的疗效无关. 抗病毒治疗前后对于不同病毒序列的测定研究，实际上与病情变化前后的研究是类似的. 同样我们不能根据病情变化前后少数的HBV基因序列的改变，就妄下结论，认定这样的基因序列不同或变化就是引起病情变化的病毒基因序列方面的原因. HBV准种特点的认识，使我们从根本上改变了对于HBV存在状态的认识，避免了只见树木，不见森林的片面性. 第三，引入准种的概念，使我们对于抗病毒治疗的艰巨性和复杂性有了一个全新的认识. 因为慢性乙型肝炎患者血清中的HBV具有多样性，不同的病毒对于不同的抗病毒药物的敏感性完全不同，这样就不奇怪一种抗病毒药物治疗的效果极其有限的事实了. 从HBV与人免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的生活周期及致病特点的相似性来看，一种抗病毒药物实难解决HBV的抗病毒治疗的问题. 在抗HIV-1治疗过程中形成的鸡尾酒疗法，即目前广泛应用的高活性抗逆转录病毒疗法(HAART)的一些理念和做法是颇值得借鉴的. 虽然在抗HBV治疗过程中陆续有人提出应该采取"联合治疗(combined therapy)"和"序贯治疗(sequential therapy)"的想法，但是目前由于抗HBV可供选择的有效药物种类十分有限，而且没有切实的临床疗效的证据，只是停留在理论上，而没有实际可供操作的具体方案. 第四，引入准种的概念，使我们认为有必要对于目前的检测手段进行审慎选择和改进. 在特异性检测技术建立之前，在有效的抗病毒治疗药物的应用之前，在进行有效的免疫预防接种之前，HBV的存在与传播方式处于相对自由与宽松的环境，其存在与分布主要由其自身的特点来决定的. 但是，随着特异性检测技术的应用和抗病毒药物的应用，以及重组疫苗的广泛应用，HBV的生存和传播的环境条件已经大大改变，因此，我们今天所面临的HBV种群，与特异性检测技术和抗病毒治疗技术出现之前的情况相比较，已经发生了相当大的改变，而且这种改变还在继续进行下去. 如果我们总是被动等待，可以设想，在将来的某一天，我们的检测手段所覆盖的病毒种群逐渐萎缩，我们将会面临更多的抗药病毒株. 那时，我们目前的检测手段的漏检率就会增加，输血不再是安全的. 治疗上我们会面临更为严峻的挑战. 因此，我们必须从现在起，以准种的眼光重新审视HBV的存在状态和特点，未雨绸缪，设计新型的检测方法和治疗药物. 否则，我们将会陷入十分被动的局面. 这决不是威人耸听. 第五，引入准种的概念，使我们对于免疫预防的任务艰巨性有了深刻的了解. 将来的免疫预防的的主要对象不是目前广泛存在的野生型病毒，而是发生了明显的变异的病毒株，这样根据主要的流行野生型病毒的设计的疫苗的免疫预防效果就会显著降低，为了应付将来出现的免疫预防的新局面，必须以准种的观点来看待乙型肝炎免疫预防的课题，才不至于将来有一天措手不及. 从目前免疫预防失败的儿童血清中检出的HBV基因序列已经发生了显著变异的事实来看，也非常支持这一观点[41-50].

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2   乙型肝炎病毒的反式调节
    病毒基因表达的调节与哺乳动物细胞的基因表达的调节一样，主要是转录水平的调节. 转录水平的调节方式和机制包括顺式(cis)调节机制和反式(trans)调节机制，HBV基因表达的反式调节机制对于HBV的生活周期、与病毒性肝炎发病机制之间的相互关系有十分密切的关系[51-57]. 乙型肝炎病毒基因组中具有公认的4段启动子的序列(SP-I、SP-II、CP、XP)，指导不同的开放读码框架(ORF)的转录过程，这种调节方式是基因结构内部的调节，属于顺式调节机制; 乙型肝炎病毒的X蛋白以及肝细胞中某些转录调节因子与HBV DNA的调节基因序列相结合，并对于HBV DNA的复制和表达产生的调节作用，称为反式调节作用[58-63]. 乙型肝炎病毒的反式调节包括以下几种不同的类型: 第一，HBV基因组编码产物对于其自身的启动子结构的激活，例如X蛋白对其核心启动子(CP)的反式激活，可以刺激前-C和前基因组启动子的转录表达. 第二，HBV基因组的编码产物对于异源性基因启动子的反式激活作用，如丙型肝炎病毒(HCV)的核心蛋白对于HBV表面抗原蛋白的编码基因启动子-I(SP-I)具有反式调节作用. 第三，HBV基因组编码的蛋白对于肝细胞基因组中启动子的转录活性具有反式调节作用，例如HBV羧基末端截短型表面抗原中蛋白(MHBst)对于肝细胞中的原癌基因c-myc的启动子具有反式激活作用. 第四，肝细胞中某些转录因子蛋白对于HBV基因组中的启动子序列具有反式激活作用，例如在肝细胞中存在肝细胞核因子1(HNF1，hepatocyte nuclear factor 1)，与HBV基因组中特异性的启动子序列之间的结合与反式调节作用，决定了HBV生活周期的嗜肝细胞特性. HNF1只有在肝细胞中表达，这种转录激活因子的存在，对于HBV基因组中的SP-1、SP-II等启动子的活性具有较强的反式激活作用，决定HBV只有在肝源性细胞系中才能有效地进行复制和表达. 第五，由于存在缺失型HBV，能够正常编码反式激活蛋白的HBV对于基因缺失突变造成反式激活蛋白合成缺如的HBV缺陷型病毒株的反式调节，是慢性HBV感染者外周血中可以维持其准种特点的主要原因[64-71].



    HBV DNA基因组编码的病毒蛋白中至少包括2种不同转录激活因子，如X蛋白和羧基末端截短的表面抗原中蛋白. X蛋白的反式激活作用，与HBV DNA的有效复制过程密切相关. HBV基因组编码的MHBst是HBV感染与HCC发生发展之间密切相关的反式激活因子. 虽然目前来看这种反式激活蛋白在HBV DNA的复制和表达的调节中的作用还不清楚，但是在反式激活细胞中的原癌基因，促进细胞的恶性转化方面具有十分重要的意义. 这些方面已经积累了大量丰富的研究资料[72-78].

    关于HBV基因准种特点的研究认识到，慢性HBV感染者体内的病毒具有多种多样的突变形式，包括几乎所有的突变类型，其中包括终止密码子的提前出现，这样造成了许多HBV蛋白的编码功能受到影响，或者完全丧失. 如果表面抗原的编码基因出现这样的情况，那么这株病毒就不能很好地编码病毒的表面抗原，仅靠自身的编码功能，这株病毒是不能生存的. 那么为什么这样的病毒还会存在下来，原因就是表面抗原没有发生突变的病毒所表达的表面抗原蛋白，仍然可以以反式的方式提供表面抗原蛋白给这种发生突变的病毒，供其包装使用. 所以这些发生突变的病毒与野生型的病毒可以共存. 同样的道理，如果HBV DNA多聚酶区发生提前终止，这株病毒就不能编码HBV DNA聚合酶，这样的病毒同样自身难以完成其生活周期，需要其他病毒的反式调节的补充. 病毒发生变异是持续存在的，彼此之间通过反式调节机制，互通有无，相互借助，从而造成慢性HBV感染者血液中存在大量的缺失突变的病毒，因此，反式调节机制是野生型病毒的调节的一般方式，同时也是突变型病毒的存活所依赖的重要机制. 因此，慢性HBV感染者体内的HBV存在状态是多种多样的，反式调节机制是其重要的原因[79-83].



    3   外周血中截短型表面抗原中蛋白的发现
    在很早之前就注意到DNA病毒与人类长期共存的过程中，其遗传物质相互交换，始终而广泛存在. 即使是逆转录病毒这一类在生活周期中存在前基因组DNA(pre-genomic DNA)阶段的特殊病毒形式，也存在病毒基因组DNA与细胞基因组DNA整合的情况. HBV DNA属于DNA病毒，其复制的生活周期是DNA-RNA-DNA的复制过程，当然也会存在HBV DNA与肝细胞基因组DNA之间的整合. 当然，目前发现在肝细胞之外的HBV DNA也有与宿主细胞DNA整合的情况. 由于从流行病学、临床医学资料上来看，HBV DNA的整合与肝细胞癌的发生发展又十分密切的关系，所以多年来一直受到人们的广泛重视[84-97]. 关于HBV DNA与肝细胞基因组DNA之间的整合及其生物学和医学意义已经有较多的研究. 目前认为，虽然在染色体上找到一些HBV DNA整合的位点，但是一般来说，HBV DNA的整合还是随机的，不是定点整合的方式. HBV DNA整合破坏了正常染色体的结构，有时会引起异常的染色体转位，这是造成HCC发生的重要机制所在. 另外，HBV DNA整合，特别是具有反式功能的病毒蛋白编码基因的整合在HCC发生发展中具有重要意义. 从目前的资料来看，HBV DNA中的X基因不仅是经常发生整合的基因片段，也是最受重视的HBV DNA编码的反式激活蛋白. 最近几年来，在HCC组织中发现了HBV DNA表面抗基因的整合，由于整合的基因片段不是全长的表面抗基因片段，只是包括前-S2和S基因的氨基末端的部分编码基因序列，因此这种整合的病毒基因片段可以编码一种截短型的表面抗原中蛋白(MHBst). 后来的研究证实，与X蛋白一样，MHBst具有显著的反式激活效应. 因此，作为一种反式激活蛋白，MHBst得到了空前的重视，同时为HBV与HCC发生之间的相关性找到了另外一条癌变通路[98-105].



    如前文所述，最初的具有反式激活作用的MHBst的编码基因是从HCC整合在肝细胞基因组DNA中的HBV DNA片段中发现的，之后所发现的MHBst编码基因也都是从HCC组织中克隆的，人们深信只有在HCC中才具备编码反式激活作用的MHBst的编码基因. 但是，董菁 et al [20]首次报道在慢性HBV感染者外周血中克隆到MHBst编码基因，并进一步证实这种羧基末端截短的MHBst具有显著的反式激活作用. 除了应用基因的共转染技术，证实MHBst表达载体的共转染可以显著反式激活异源性启动子SV40早期即刻启动子的转录活性之外，而且还利用基因芯片技术、抑制性消减杂交技术(SSH)、异源性启动子指导的报告基因表达载体的共转染技术等证实从外周血克隆的乙型肝炎病毒MHBst是具有显著的反式激活作用的. 从SSH的筛选过程中，我们发现MHBst可以激活原癌基因c-myc的表达，之后应用Western blot杂交技术进一步证实了这种对于原癌基因反式激活和上调的作用，进一步指出，MHBst在HCC发生中具有十分重要的作用[106-109].



    目前研究表明，MHBst的反式激活效应可能与蛋白激酶C(PKC)依赖的信号转导途径有关，前-S2区域与PKCa/b结合发生磷酸化反应，触发PKC依赖的c-Raf-1/MAP2-激酶信号转导链式反应，结果激活了转录因子如AP-1、NF-kB、AP-2、SRE、Sp1和c-myc、c-fos启动子，参与病毒感染后的炎症反应和肝细胞癌的发生. MHBst蛋白结构的改变，缺失了位于C-末端的膜定位信号，使MHBst在未能进入分泌途径而在内质网(ER)中滞留，其前-S2区指向胞质区与胞质蛋白相互作用，产生转录激活功能; 而全长的MHBs蛋白的前-S2区指向ER腔，进入高尔基复合体而分泌. 所以说MHBst的反式激活功能依赖于其N-末端前-S2区的胞质定位功能. 而缺失突变的范围是决定该截短型分子是否具有反式激活作用的重要影响因素，MHBst至少完全缺失蛋白C-末端S区的疏水区Ⅲ，才具有反式激活功能; S区的N-末端疏水区Ⅰ是反式激活所必需的，因为蛋白与膜的结合是转录激活功能所必需的，这段序列被称为"反式活性开启区"(trans-activity-on region，TAO). 进一步研究表明，MHBst 的最小反式激活单元定位于4-53氨基酸残基，MHBst53 是其中最小的转录激活因子，是一种非膜结合类型的MHBst，就是说，仅前-S2区(aa 1-55)就足以介导反式效应，说明作为反式激活剂的MHBst大小范围是很大的.  我们目前正在构建不同截短范围的表达载体，进一步研究MHBst的反式激活功能，筛选和克隆其反式激活的靶基因[110,118].



    4   乙型肝炎病毒新型开放读码框架的研究
    乙型肝炎病毒基因组的紧密结构特点是十分突出的，表现在调节基因与结构基因序列的重叠、不同结构基因区段之间的重叠. 令人惊奇的是同一段基因序列，可以同属于不同的功能区段，而又不相互影响，最大效率地充分利用了3 200 bp的全基因组结构，完成其复制和表达的严密调节. HBV DNA病毒这一结构特点是十分突出的. 相互重叠的结构特点，造成的一种局面就是某一位点或者是某些位点的改变，不仅仅具有单一的影响，而是影响深远. 传统的观点认为我们对于HBV DNA的结构特点已经有了深刻的认识，其实我们对于HBV DNA结构与功能、表达与调控的特点还有许多问题没有认识清楚. 关于HBV DNA基因序列之中是否还具有新型的编码基因序列，以及这些新型的编码基因序列存在的生物学意义、医学意义如何，始终是我们应该关注的一个重要问题.



    董菁et al [119, 120]应用长距离精确的多聚酶链反应技术(LA-PCR)从慢性HBV感染者血清中扩增克隆了全长的HBV DNA全基因序列，从而建立了中国流行株的HBV DNA全基因序列. 通过对中国流行株HBV DNA序列与其他已经克隆的HBV DNA基因序列进行系统的比较发现，在HBV DNA基因组序列中可能还存在新型的编码基因区. 对于前-X(pre-X)基因区和前-前-S(pre-pre-S)基因区的断定就是对于HBV DNA结构与功能的重要的新认识. 通过对不同地域来源的HBV DNA基因组序列的比较，发现HBV DNA序列中存在的前-X基因位于X基因的上游，与X基因的框架结构一致，但是X基因具有其自身的起始密码子. 从中鉴定的HBV前-X基因序列长度为168 nt，编码产物为55 aa，分子量为6.2 kD，对于其蛋白质一级结构序列进行分析发现，序列中含有15个疏水氨基酸残基，24个极性氨基酸残基，9个丝氨酸残基，表明具有潜在的磷酸化位点. 对于GenBank中收录的HBV基因序列进行分析比较，发现有18个序列含有前-X序列，同源性在85-94 %之间. 前-前-S基因序列长度为135 nt，编码产物为43 aa，分子量为5.2 kD，对于其蛋白质一级结构序列进行分析发现，由19个疏水氨基酸残基，10个极性氨基酸残基，5个强碱性氨基酸残基，3个丝氨酸残基. 对于GenBank中收录的HBV基因序列进行分析比较，发现有5个克隆有前-前-S序列，序列的同源性在66-95 %之间. 这2个新型开放读码框架的确定，使我们对于HBV基因组中的编码基因序列有了新的认识，为进一步研究HBV的生活周期、致病机制，以及新型诊断技术等开辟了新的研究方向.



    5   乙型肝炎病毒全基因序列的认识
    关于HBV全基因序列的克隆化，早在1979年就已经完成. 这在分子生物学技术还不是特别完善的年代显得多么的难能可贵. 随着1985年聚合酶链反应技术的出现和不断发展，使得HBV DNA基因序列的扩增和克隆化变得十分容易. 而且据此还建立了HBV DNA的定性和定量的PCR扩增技术，在慢性HBV感染患者的病毒载量测定中发挥着十分重要的作用[121-127]. 与此同时，世界上各个国家对于HBV DNA的全基因序列也进行了研究，在美国生物信息学中心建立的核苷酸序列数据库GenBank中注册的HBV DNA全基因序列已经达到200条以上. 如前文所述，对于这些HBV DNA全基因序列克隆的方法学进行推敲，不难发现这些基因序列存在严重的问题，因为是从1例HBV患者的血清中同时获得多个HBV DNA片段，相互重叠的基因片段之间进行拼接，从而完成HBV DNA全基因序列的确定. 如果从准种的观点来看，慢性HBV感染者体内存在千差万别的HBV，随机地选择含有HBV DNA片段的克隆进行测序，尽管重叠部分的序列可能是同源，但是要保证全部的基因片段都是来源于同一株病毒，从理论上来讲几乎是不可能的. 换一句话说，在GenBank中注册的绝大部分的HBV DNA基因全序列都是从不同的HBV病毒株来源的基因序列，实际上是一个嵌合体，并不能代表真正存在的HBV DNA的全基因序列. 符合这种基因序列的HBV是根本不存在的. 因此，我们对于HBV DNA基因序列的认识，一定要从准种的特点去认识，才能更加全面和正确[128-134].



    既然HBV慢性感染者体内的HBV DNA基因序列千差万别，不能应用分段克隆的技术对于HBV DNA全基因序列进行分析，那么就必须设计扩增全长的HBV DNA的PCR技术. 随着具有特殊功能的DNA多聚酶的发现和应用，使一次扩增HBV DNA全长的基因组成为可能. 董菁et al [119]应用LA-PCR从2例慢性HBV感染者的血清中获得了5个克隆的全长HBV DNA基因序列. 5个克隆的全长HBV DNA序列都属于adr亚型，长度也都是在3 200 bp左右，但是其基因序列却有显著的差别，即使是来源于同一个患者的HBV DNA全基因序列之间也有显著的不同. 不仅仅是个别核苷酸或氨基酸残基序列的差别，而且还有大段的缺失、插入、终止密码子的提前出现等几乎所有的基因突变形式. 可以说，在1例慢性HBV感染者血清中很难找到完全一样的HBV DNA全长基因序列. 即使是HBV基因序列小的编码基因或调节基因片段序列完全一样的几率都很低，何况长度达到3 200 bp的全长HBV DNA. 慢性HBV感染者体内的HBV DNA全长基因序列不是一成不变的，而且是随着HBV DNA的不断复制和机体免疫力的不断变化，甚至是抗HBV药物的应用，改变了环境对于HBV生存的压力，HBV DNA基因序列始终处于不断的变化之中[135-140]. 如果认识到这一点，有很多问题就可以进行解释了. 例如，关于HBV DNA全长基因序列参考的问题，在我们看来，目前还没有什么所谓的HBV DNA参考株 (reference strain) 或者是标准株 (standard strain)，因为HBV DNA序列的多样性，而且又始终处于不断的变化之中，实际上这种标准株或称为参考株是不存在的，认为规定哪一株HBV DNA病毒基因序列作为中国人群流行的标准株或者参考株都是没有多大意义的. 认识了HBV DNA全长基因序列的存在特点，我们对于HBV本身的结构与功能、表达与调控，HBV感染的结局与其与抗病毒治疗疗效判定有关的HBV DNA基因序列的改变，都会有一个全新的认识。