不同肝病患者抗肝抗原自身抗体的研究

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阎惠平 ＷｉｎｆｒｉｅｄＳｔ ｃｋｅｒ　贺立香　张世斌　李秀惠　黄德庄　赵春惠

作者单位:北京佑安医院北京市肝炎研究所(阎惠平,贺立香,张世斌,李秀惠,黄德庄,赵春惠);德国ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ实验免疫制品有限公司(ＷｉｎｆｒｉｅｄＳｔ ｃｋｅｒ)
通讯作者:阎惠平,100054北京佑安医院(Ｅ ｍａｉｌ:ｙｈｐ503@ｓｉｎａ.ｃｏｍ)


【摘要】　目的　观察我国不同类型肝病患者中几种抗肝抗原自身抗体的存在状况;探讨自身免疫性肝脏疾病的自身抗体特征。方法　由1412例标本中选择230例肝功能异常患者分为5组:①自身免疫性肝病组42例:自身免疫性肝炎(ＡＩＨ)18例、原发性胆汁性肝硬化(ＰＢＣ)21例、原发性硬化性胆管炎(ＰＳＣ)3例。②ＨＡＶ组23例;③ＨＢＶ组70例;④ＨＣＶ组35例;⑤非甲～戊型肝炎组60例。用间接免疫荧光、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、酶免疫条带技术等分别检测抗核抗体(ＡＮＡ)、抗线粒体抗体(ＡＭＡ)、平滑肌抗体(ＳＭＡ)、肝肾微粒抗体Ⅰ型(ＬＫＭ 1)、肝细胞胞溶质抗原Ⅰ型(ＬＣ 1)、可溶性肝抗原(ＳＬＡ) 肝胰抗原(ＬＰ)和ＡＭＡ Ｍ2亚型,以及ＳＳ Ａ、ＳＳ Ｂ、ｄｓＤＮＡ等多种抗体。结果　1412例中诊断ＡＩＨ、ＰＢＣ和ＰＳＣ者分别为送检标本的1.27%,1.49%和0.21%。230例血清中2例ＬＫＭ 1阳性和2例ＳＬＡ ＬＰ阳性,分别见于ＡＩＨ和ＨＣＶ感染者。ＰＢＣ患者ＡＭＡ和Ｍ2全部阳性;其ＡＮＡ以核膜型为主(7 14);ＡＩＨ患者ＡＮＡ抗体未见特定的荧光类型,而抗 Ａｃｔｉｎ仅见于ＡＩＨ者。非甲～戊组4例ＡＭＡ和Ｍ2阳性,3例ＳＭＡ高滴度阳性,4例出现ＳＳ Ａ、ＳＳ Ｂ或ｄｓＤＮＡ等抗体。结论　肝抗原抗体和ＡＮＡ及ＡＭＡ分型的检测有助于自身免疫性肝病和重叠多种免疫性肝病的诊断;非甲～戊型肝炎诊断时应考虑自身免疫性疾病。
【关键词】　肝炎;自身免疫性肝炎;原发性胆汁性肝硬化

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自身免疫性肝脏疾病包括自身免疫性肝炎(ａｕ ｔｏｉｍｍｕｎｅｈｅｐａｔｉｔｉｓ,ＡＩＨ)、原发性胆汁性肝硬化(ｐｒｉ ｍａｒｙｂｉｌｉａｒｙｃｉｒｒｈｏｓｉｓ,ＰＢＣ)和原发性硬化性胆管炎(ｐｒｉｍａｒｙｓｃｌｅｒｏｓｉｎｇｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ,ＰＳＣ)。自身免疫抗体的检测对这类疾病的诊断有相当重要的意义。但迄今为止,由于对自身抗原的认识和抗肝抗原自身抗体检测方法有限,且某些自身抗体缺乏疾病特异性,不仅见于自身免疫性疾病,也出现于10%～15%的病毒性肝炎或其它免疫介导的疾病中,给临床诊断增加了许多复杂性〔1〕。为探讨包括抗肝肾微粒体抗体Ⅰ型(ｌｉｖｅｒ ｋｉｄｎｅｙｍｉｃｒｏｓｏｍａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ,ＬＫＭ 1)、抗可溶性肝抗原(ｓｏｌｕ ｂｌｅｌｉｖｅｒａｎｔｉｇｅｎ,ＳＬＡ)、抗肝胰抗原(ｌｉｖｅｒ ｐａｎｃｒｅａａｎｔｉ ｇｅｎ,ＬＰ)和抗肝细胞胞溶质抗原Ⅰ型(ｌｉｖｅｒｃｙｔｏｓｏｌｉｃ 1,ＬＣ 1)在内的肝抗原自身抗体在我国肝病患者中的存在状况和意义,此项研究自1412例初筛的血清标本中选择了230例有明确肝功能损伤的各种类型肝病患者,检测了其血清中抗肝抗原抗体和抗核抗体(ａｎｔｉ ｎｕｃｌｅａｒａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ,ＡＮＡ)、抗平滑肌抗体(ｓｍｏｏｔｈｍｕｓｃｌｅａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ,ＳＭＡ)等自身抗体。材料和方法研究对象:1998～2001年间北京佑安医院收治的主要来自北京地区的1412例各种原因所致肝功能异常血清标本,首先以间接免疫荧光法检测了常见的自身抗体。再从中选择230例标本用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ及免疫酶条带技术等方法检测ＬＫＭ 1、ＳＬＡ ＬＰ、ＬＣ 1、抗细胞核不同成分抗体和抗线粒体抗体(ＡＭＡ)亚型等抗体。230例患者分为5组:①自身免疫性肝病组(ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｌｉｖｅｒｄｉｓｅａｓｅｓ)42例:其中ＡＩＨ18例、ＰＢＣ21例、ＰＳＣ3例。男∶女=4∶38,平均年龄53.3岁(28～69岁)。诊断标准参考文献〔2,3〕。②甲型肝炎组(ＨＡＶ)23例,均为抗ＨＡＶＩｇＭ阳性者。③乙型肝炎病毒感染组(ＨＢＶ)70例。④丙型肝炎组(ＨＣＶ)35例。⑤非甲～戊型肝炎组(ＮｏｎＡ～Ｅ)60例。实验方法1 间接免疫荧光法(ＩＩＦ)检测ＡＮＡ、ＡＭＡ、ＳＭＡ、ＬＫＭ 1、抗肝特异性蛋白(ＬＳＰ)等自身抗体:选择ＨＥｐ 2细胞和5种组织(猴肝脏和心肌组织、大鼠肝、肾和胃组织)的冰冻切片作为抗原,采用生物薄片马赛克技术(ｂｉｏｃｈｉｐｍｏｓａｉｃ)将带有细胞和组织的6种切片组合成一个反应区(Ｅｕｒｏｉｍｍｕｎ,Ｇｅｒｍａｎｙ)。4℃保存备用。待检血清自1∶100起稀释,与组织细胞孵育30ｍｉｎ;加入异硫氰酸荧光素(ＦＩＴＣ)标记的抗体结合30ｍｉｎ;洗片、封片后荧光显微镜观察结果。组织或细胞内出现特异性绿色荧光、血清稀释度>1∶100为阳性〔2〕。2 酶免疫条带实验技术(Ｅｕｒｏａｓｓａｙ)分别作以下检测1)抗肝抗原自身抗体的检测:选择3种人的基因重组抗原(细胞色素Ｐ450ⅡＤ6、可溶性肝抗原 肝胰抗原和亚胺甲基转移酶 环化脱胺酶)分别用于检测ＬＫＭ 1、ＳＬＡ ＬＰ和ＬＣ 13种抗体。重组抗原分别包被于2条ＮＣ膜上,同时包被抗人ＩｇＧ作为实验对照。2条膜固定于载玻片上,组合为一个反应区。将待检血清1∶100稀释后与膜反应,振荡作用30ｍｉｎ;加酶标记抗人ＩｇＧ抗体孵育30ｍｉｎ;ＮＢＴ ＢＣＩＰ显色15ｍｉｎ。水终止反应,观察特定区域条带的有无判定结果。(2)ＡＭＡ Ｍ2亚型抗体的检测:将纯化Ｍ2抗原平行包被于膜条上,同时包被抗人ＩｇＧ作为实验对照。膜的固定及血清检测方法见文献〔4〕。(3)ＡＮＡ亚型抗体的检测:多种细胞核成分(ＳＳ Ａ,ＳＳ Ｂ,ｄｓＤＮＡ,ＲＮＰ Ｓｍ,Ｊｏ 1ａｎｄＳｃｌ 70等)的高纯度抗原分别包被于检测膜条上,固定后检测血清,方法基本同(1)所述。3 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ方法作以下检测1)多种抗肝抗原抗体:由猴的肝脏抽提抗原、纯化、经Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ分离蛋白并转移至ｂｌｏｔ膜上。这些抗原包括5种不同相对分子质量(Ｍｒ)的ＡＭＡ Ｍ2亚型抗原(Ｍｒ74×103、55×103、51×103、45×103、36×103)、ＬＫＭ 1及细胞角蛋白8 18等抗原,同时包被重组质粒表达的ＳＬＡ ＬＰ抗原。检测主要步骤为:包被膜置于缓冲液中预处理15ｍｉｎ,弃液体;将待检血清1∶50稀释与膜在水平振荡条件下作用60ｍｉｎ,充分洗膜后加入酶标记抗人ＩｇＧ孵育60ｍｉｎ;以ＮＢＴ ＢＣＩＰ显色、水终止反应。用ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ公司提供的标准条带图比较,判定结果。(2)ＡＮＡ亚型抗体:Ｈｅｐ 2细胞核抗原经分离纯化、电泳、转膜,检测方法同(1)。以上主要试剂来源和技术支持由德国ＥＵＲＯＩＭＭＵＮ实验免疫试剂公司提供。所用抗原和试剂盒经美国ＣＤＣ标准品验证具有良好的特异性。4 ＥＬＩＳＡ方法检测全部血清的病毒性肝炎指标:抗 ＨＡＶＩｇＭ、ＨＢｓＡｇ、抗 ＨＢｓ、ＨＢｅＡｇ、抗 ＨＢｅ、抗 ＨＢｃ、抗 ＨＣＶＩｇＭ和ＩｇＧ、抗 ＨＥＶＩｇＭ和ＩｇＧ等。结果1 间接免疫荧光法检测肝功能异常患者中自身免疫性疾病的检出率:1412例中诊断ＡＩＨ18例,占送检标本的1.27%,ＰＢＣ21例,占1.49%,ＰＳＣ3例,占0.21%,干燥综合征(ＳＳ)7例,占0.49%,其它自身免疫性疾病(系统性红斑狼疮、自身免疫性溶血性贫血及类风湿性关节炎等)7例,占0.49%。2 从上述1412例标本中根据病原学或病因诊断,选择了230例标本分为5组,用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ及酶免疫条带技术,检测其中几种抗肝抗原自身抗体、ＡＭＡ及Ｍ2亚型抗体和ＳＭＡ(包括抗 肌动蛋白,Ａｃｔｉｎ)的结果见表1。表1结果显示,经ＩＩＦ初筛,31例患者ＡＭＡ阳

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性。而后,230例标本用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ和Ｅｕｒｏａｓｓａｙ方法分别检测了ＡＭＡ Ｍ2亚型抗体,分别有21例和28例阳性,均在31例ＡＭＡ阳性者之中。ＳＬＡ ＬＰ抗体阳性标本经过2种方法重复实验证实,结果是可靠和稳定的。其中1例同时抗 ＨＣＶＩｇＧ阳性、ＡＮＡ阳性(1∶1000,核仁型);轻度黄疸,ＡＬＴ未高于100Ｕ Ｌ。另1例诊断为ＰＳＣ,作者依据文献〔5〕作回顾分析,该例也基本符合ＡＩＨ诊断。ＬＫＭ 1阳性标本也经过不同方法重复检测证实。其中1例男性10岁儿童,急性肝炎表现,抗 ＨＣＶ阳性,给予一般保肝治疗好转。另1例ＡＩＨ患者同时ＡＭＡ和Ｍ2弱阳性。3 42例自身免疫性肝病患者的自身抗体主要表现形式见表2。表2　42例自身免疫性肝病患者的自身抗体主要表现形式

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如表2所示,ＰＢＣ患者ＡＭＡ和Ｍ2亚型全部阳性;21例中ＡＮＡ阳性14例,其荧光类型以核膜型为主(7 14),其次为着丝点型或伴有细胞核点型。ＬＫＭ 1和ＳＬＡ ＬＰ抗体阳性者各有1例计为ＨＣＶ组。4 非甲～戊肝组60例中,15例免疫荧光法检测ＡＮＡ阳性≥1∶320,进一步检测发现4例存在ＳＳ Ａ、ＳＳ Ｂ或ｄｓＤＮＡ等自身抗体。这4例均为女性,单项ＡＬＴ异常1例,急性肝炎2例、慢性肝炎1例,(ＡＬＴ73～542Ｕ Ｌ,ＩｇＧ均在正常范围)。2 60例抗 Ａｃｔｉｎ阳性达1∶1000;1例ＳＭＡ1∶1000伴ＡＮＡ阳性;此3例(2男1女)为急性发病,ＡＬＴ185～823Ｕ Ｌ,ＩｇＧ19.3～21.9ｇ Ｌ,均高于正常。4 60例ＡＭＡ和Ｍ2都阳性,其中3例ＡＮＡ同时阳性(ＡＣＡ或核膜型):重症肝炎1例,慢性肝炎早期肝硬化3例。上述结果提示,在此组病人中至少存在ＡＩＨ和ＰＢＣ这2种自身免疫性疾病。讨论自身免疫性肝脏疾病的诊断需要综合临床、病理、实验室生化和免疫学指标,自身抗体及遗传特征等多种因素。约70%～80%的ＡＩＨ病人表现高滴度的ＡＮＡ和ＳＭＡ(Ⅰ型ＡＩＨ)或ＬＫＭ 1抗体(Ⅱ型ＡＩＨ),而其余患者可能只表现抗ＳＬＡ抗体(Ⅲ型ＡＩＨ),由于开展抗 ＳＬＡ检测的实验室目前较少,故诊断存在一定困难。ＬＫＭ 1的靶抗原为细胞色素Ｐ4502Ｄ6,有报道认为其与ＨＣＶ病毒基因序列有部分同源性,因此部分ＬＫＭ 1抗体阳性者同时存在ＨＣＶ抗体。而ＳＬＡ的靶抗原过去认为是细胞角蛋白8 18或谷胱甘肽 Ｓ 转移酶,但2000年Ｗｉｅｓ〔6〕等报道,用克隆的ＳＬＡ片段与基因文库比较,它既不是细胞角蛋白8 18也不是谷胱甘肽 Ｓ 转移酶,而是

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与抗肝胰抗原(ｌｉｖｅｒｐａｎｃｒｅａｓ,ＬＰ)为同一种自身抗体,故称为ＳＬＡ ＬＰ。关于ＬＣ 1抗体,国内外报道都较少,Ｌｅｐｉｅｒｒｅ等〔7〕认为肝脏中的亚胺甲基转移酶(ｆｏｒｍｉｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｃｌｏｄｅａｍｉｎａｓｅ,ＦＴＣＤ)为ＬＣ 1识别的特异性抗原。抗ＬＣ 1多与ＬＫＭ 1同时出现,也可单独存在于ＡＩＨ病人中。这些抗体都具有较高的诊断特异性,国外有报告认为仅在ＡＩＨ患者血清中检出ＳＬＡ ＬＰ抗体。自身免疫性肝炎和原发性胆汁性肝硬化在我国的发病和患病状况迄今尚不清楚。此文报道了上述几种自身抗体在中国的肝病病人中存在状况的研究结果,旨在为临床学家和研究者认识这种疾病提供可靠的实验依据。此项研究表明,ＬＫＭ 1和ＳＬＡ ＬＰ抗体在我国肝病患者中的检出率较低,尚未发现ＬＣ 1阳性者。1例ＨＣＶ感染者存在ＳＬＡ ＬＰ抗体。根据国外报道,ＡＩＨ与ＰＢＣ,ＡＩＨ与ＰＳＣ都可以重叠出现于同一病人,即重叠多种免疫性肝病(ｏｖｅｒｌａｐｓｙｎｄｒｏｍｅｓ)〔8〕,此项研究中少数患者的特点表明有这种情况的存在。此时,ＳＬＡ ＬＰ阳性可能是提示与ＡＩＨ重叠的指标,但目前如何依据临床和实验室指标对ｏｖｅｒｌａｐｓｙｎ ｄｒｏｍｅｓ给予确切诊断和分型还需要进一步研究。本文中的ＡＩＨ患者17 18例ＡＮＡ阳性,但免疫荧光法未见到较为特定的表现型,可以表现着丝点型、颗粒型、核仁型、均质型、ＳＳ Ａ及ＳＳ Ｂ等多种类型,并且多以两种以上混合类型出现;抗Ａｃｔｉｎ仅见于ＡＩＨ患者。对230例标本的检测结果表明,Ｍ2抗体仅存在于ＡＭＡ阳性者血清中;ＰＢＣ患者ＡＭＡ及其Ｍ2亚型全部阳性,说明这两种抗体是本病的特异性诊断指标。ＰＢＣ患者出现的ＡＮＡ,半数(7 14)为核膜型,其次为着丝点型或伴有细胞核点型,并不提示存在重叠多种免疫性肝病;如果出现ＳＳ Ａ、ＳＳ Ｂ、ＬＫＭ等其它自身抗体时,则提示同时存在其它自身免疫性疾病的可能。关于非甲～戊型肝炎,此研究中部分病例为回顾性研究,结果提示在这组病人中有少数病例可能应诊断为自身免疫性疾病。例如4例ＡＭＡ及其Ｍ2亚型均阳性者的特征符合表2所示ＰＢＣ患者的特征,只是临床上尚未形成典型的肝硬化;分析此组病人漏(误)诊原因可能有:临床特征不典型;急性发病,经一般保肝治疗好转,未能长期追踪;缺乏组织学诊断;自身免疫性肝脏疾病的检测手段和医师对此类疾病的认识都有待完善等。因此,对原因不明的肝炎患者及时检测自身抗体将有助于疾病的诊断和鉴别诊断。参考文献1　ＭｃＦａｒｌａｎｅＩＧ.Ｌｅｓｓｏｎａｂｏｕｔａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｈｅｐａｔｉｔｉｓ.Ｌａｎｃｅｔ,2000,355:1475 1476.2　赵景涛,刘玉兰主编.21世纪医师丛书消化内科分册.北京:中国协和医科大学出版社,2000,235 240.3　叶维法,钟振义主编.肝病免疫学.天津:天津科学技术出版社,1997,361 398.4　阎惠平,Ｓｔ ｃｋｅｒＷ,胡翔鹄,等.肝炎和肝硬化患者血清抗线粒体抗体及其亚型的检测.中国实验临床免疫学杂志,1999,11:7 10.5　ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＨｅｐａｔｉｔｉｓＧｒｏｕｐＲｅｐｏｒｔ:ＲｅｖｉｅｗｏｆＣｒｉｔｅｒｉａｆｏｒＤｉａｇｎｏｓｉｓｏｆＡｕｔｏｉｍｍｕｎｅＨｅｐａｔｉｔｉｓ.ＪＨｅｐａｔｏｌ,1999,31:929 938.6　ＷｉｅｓＩ,ＢｒｕｎｎｅｒＳ,ＨｅｎｎｉｎｇｅｒＪ,ｅｔａｌ.ＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔａｒｇｅｔａｎｔｉｇｅｎｆｏｒＳＬＡ ＬＰａｕｔｏａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｉｎａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｈｅｐａｔｉｔｉｓ.Ｌａｎｃｅｔ,2000,355:1510 1515.7　ＬａｐｉｅｒｒｅＰ,ＨａｊｏｕｉＯ,ＨｏｍｂｅｒｇＪＣ,ｅｔａｌ.Ｆｏｒｍｉｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｃｙ ｃｌｏｄｅａｍｉｎａｓｅｉｓａｎｏｒｇａｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄｂｙｓｅｒａｏｆｐａ ｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｈｅｐａｔｉｔｓ.Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ,1999,116:643 649.8　ＬｏｈｓｅＡＷ,ＭｅｙｅｒｚｕｍＢｕｓｃｈｅｎｆｅｌｄｅＫＨ,ＦｒａｎｚＢ,ｅｔａｌ.Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａ ｔｉｏｎｏｆｔｈｅｏｖｅｒｌａｐｓｙｎｄｒｏｍｅｏｆｐｒｉｍａｒｙｂｉｌｉａｒｙｃｉｒｒｈｏｓｉｓ(ＰＢＣ)ａｎｄａｕｔｏ ｉｍｍｕｎｅｈｅｐａｔｉｔｉｓ:ｅｖｉｄｅｎｃｅｆｏｒｉｔｂｅｉｎｇａｈｅｐａｔｉｔｉｃｆｏｒｍｏｆＰＢＣｉｎｇｅｎｅｔｉ ｃａｌｌｙｓｕｓｃｅｐｔｉｂｌｅｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ.Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ,1999,29:1080 1084.

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欢迎订阅《生物技术通讯》《生物技术通讯》是军事医学科学院生物工程研究所主办的关于生物技术的中央级专业性学术刊物(国内统一刊号ＣＮ11-4226 Ｑ,国际标准刊号ＩＳＳＮ1009-0002),是国家科技部中国科技论文统计与分析源期刊、中国学术期刊综合评价数据库来源期刊。本刊主要报道生物技术(生物工程)及所有相关学科领域的最新科研成果与进展。主要栏目有:研究报告、技术方法、研究简报、专论、综述、论坛、讲座、经验交流等。读者对象主要为从事生物技术及其在生物医学、工业、农业、环保等领域应用的科研、教学、管理人员,大专院校相关专业师生及有关工程技术人员,以及其他对生物技术感兴趣的人员。欢迎订阅、欢迎供稿、欢迎刊登广告。《生物技术通讯》为大16开本双月刊,80页高档轻涂纸印制,每期定价10元,全年60元。国内外公开发行,国内邮发代号82-196,国外发行代号ＢＭ1433。编辑部办理邮购业务。邮政编码:100071;地址:北京丰台东大街20号;电话010)66948856;传真010)63895646;Ｅ ｍａｉｌ:ｂｉｏｌｅｔｔ@ｂｊ163.ｃｏｍ;ｓｗｔｘ@ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ.ｎｅｔ.ｃｎ

发愁的冰冰

免疫肝炎是什么呀？是乙肝的一种？

tjm2003

自身免疫性肝炎，和乙肝无关（少数可能由乙肝造成）。就是自身的免疫系统对自身的肝细胞造成的伤害。（呵呵，自己人打自己人）