蜂胶中抗肿瘤成分的研究山东省科学院生物研究所 韩利文 刘可春 王雪 侯海荣 王思锋 蜂胶作为一种天然药物，已证明其具有抗病原微生物、抗炎、免疫调节和抗肿瘤作用，特别是其抗肿瘤作用引起人们广泛的关注。研究表明蜂胶对人鼻咽癌、子宫颈癌、乳腺癌、肾癌、大肠癌等人癌细胞株均具有强烈的毒杀作用。已有多种抑制肿瘤细胞生长的有效成分已被鉴定出来，主要是咖啡酸及肉桂酸类的衍生物和黄酮类化合物等。本文就蜂胶的抗肿瘤成分及作用机理研究进展进行简要论述。 1 咖啡酸类衍生物 CAPE(咖啡酸苯乙酪)是蜂胶中一种较早被确认的抗肿瘤成分。近年国外研究报道，作为蜂胶抗肿瘤作用的主要活性成分，对人白血病细胞和多种实体瘤细胞具有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用，而且能显著抑制NIH/3T3细胞被肉瘤相关病毒MuSV-124的恶性传染。CAPE能抑制两种肿瘤细胞系的生长，调节两种细胞系中与肿瘤相关抗体的表达。CAPE可选择性诱导癌细胞株的DNA断裂。如鼠高肝转移性结肠癌26-Ij细胞株、鼠高肝转移性恶性黑色素瘤BL6细胞株、鼠肺癌LLC细胞株、人纤维肉瘤HT-1080细胞株、人肺腺癌A549细胞株和人宫颈癌HeLa细胞株的生长均有抑制作用，但不同的细胞株对，CAPE的敏感性不同。结肠癌26-L5细胞的半数致死浓度(EC50))为0.15μmol·L-1，而HeLa细胞为10.7 μmol·L-1。CAPE还可减少由致癌物氧化偶氮甲烷导致的小鼠结肠畸形腺窝灶(ACF)的形成和肿瘤的产生，而目前认为结肠黏膜ACF的形成是导致大肠癌发生的关键阶段。更值得研究人员兴奋的是CAPE及其衍生物对不同细胞具有选择性的毒性作用，对舌鳞癌、颈部牙龈转移癌等肿瘤细胞生长具有明显的抑制作用，但对黏膜成纤维细胞等正常细胞却没有作用。 CAPE的抗肿瘤作用部分机理已经被阐明。Hye等认为具有潜在的抑制肿瘤入侵及转移作用，这种作用是由细胞基质金属蛋白酶的调节决定的。细胞基质金属蛋白酶是一种Zn-依赖的蛋白水解酶，在细胞外基质的分裂增殖过程中起着关键作用。用不同剂量CAPE处理人成纤维肉瘤发现CAPE能够显著下调基因的表达水平。另外，也观察到CAPE能抑制MMP-2活化的全过程，如人侵、活动、细胞迁移、聚集，为CAPE抗肿瘤提供了有力证据。 CAPE抗肿瘤作用可能与CAPE能够修复细胞间缝隙连接有关。用CAPE处理缝隙连接缺失的WB-ras2细胞后，可引起细胞生长受抑，细胞缝隙连接明显恢复，其细胞连接相关蛋白连接素-43的表达上调并定位于细胞膜。 CAPE能够抑制肿瘤基因的表达。CAPE对TPA引起的肿瘤增长和5-经甲基-2’-脱氧尿嘧啶形成有潜在的抑制活性，在Hela细胞培养基中1.25、2.5、5、10、20 mmol·L-1的CAPE对DNA合成抑制率分别为32％、44％、朗％、79％、95％；对RNA合成抑制率分别为39％、43％、58％、64％、75％，对蛋白质合成抑制率分别为29％、30％、37％、32％、47％。CAPE处理两个p53肿瘤突变异种细胞系NCI-H358和SKOV-3及缺乏型p53细胞引起cas-pase-3和DNA断裂。 CAPE引起肿瘤细胞凋亡作用还可由p38丝裂原活化蛋白激酶通路介导。CAPE(50 μmol·L-1)处理C6胶质瘤细胞，能够诱导细胞色素C从线粒体释放到细胞浆，激活CPP32，也上调了p53、Bax和Bak基因的表达。活化了细胞外的ERKs/p38 MAPK通路，p38激酶和p53形成一个复合体，诱导p53磷酸化，使得C6胶质瘤细胞凋亡。 另外，从荷兰蜂胶中提取得到CAPE类似物咖啡酸苯乙酪、咖啡酸苯丙酯、咖啡酸肉桂醇酯。3种成分对鼠肝转移结肠癌26-L5细胞都显示了抑制作用，EC50分别为0.288、1.76和0.114 μmol·L-1。 2 肉桂酸类衍生物 近年来研究人员发现，Artepillin C (阿替匹林)及其结构衍生物是蜂胶中一类独特的对肿瘤细胞具有细胞毒性作用的活性成分。实验中发现，在体外肿瘤细胞抑制试验中，100 μ ml-1 Anepillin C发现具有明显的细胞毒作用，能够强烈抑制人肺癌HLC细胞(腺癌)、肠癌HGC细胞、鼠肝癌HTSA细胞、鼠恶性肿瘤Colon 26和B-16细胞、喉癌KB细胞、和鼠黑素瘤上皮细胞Clone M-3的DNA合成，并能引起HLC、HGC、Colon 26、人白血病细胞的细胞凋亡。在裸鼠移植HLC、HGC、Colon 26、HTSA、PLC/PRF/5、黑色素瘤细胞动物实验中，每只裸鼠瘤内注射Artepillin C 500 μg，即检测到细胞凋亡、有丝分裂中止、肿瘤细胞核溶解、肿瘤细胞死亡，最后癌病变组织被胶原限制，肿瘤细胞入侵浸润也被阻止，而人正常细胞的生长不受影响。低剂量Artepillin C(500 μg)还可以预防铁-氮基三醋酸酪(FeNTA)诱发的小鼠支气管和细支气管腺瘤恶性转化，阻止肺癌的发展。 Artepllin C 对于不同系列的人白血病细胞如T-淋巴细胞性白血病细胞、β-淋巴细胞性白血病细胞、髓性白血病细胞、非淋巴、非髓性白血病显示了明显的细胞毒作用，100 μml·L-1“处理24h，能显著诱导这些白血病肿瘤细胞凋亡，其中对T-淋巴细胞性白血病细胞作用最强。所有细胞都观察到了凋亡小体和DNA碎片。所有白血病细胞的DNA合成都受到抑制，同时显微镜观察到细胞被瓦解。白血病细胞的凋亡可能与Fas抗原的表达增强和丧失线粒体膜电位有关。试验证明 Artepllin C有抗白血病作用，但对正常的淋巴细胞仅仅是有限的抑制作用。 氧化偶氮甲烷处理DDY小鼠造成结肠癌模型，灌胃80和160 mgkg-1 蜂胶或10 mgkg-1Artepillin C (相当160 mg蜂胶)能够显著将结肠畸形腺窝灶的发生率降低39.2％，43.7％和 43.4％。Shimizu 等将 Artepllin C 加到人结肠癌腺细胞WiDr中，发现能够诱导细胞周期G(O)肥(1)期，并抑制肿瘤细胞生长。通过增强肿瘤关键蛋白Cip1/p21的活性，刺激Cip1/p21的表达来影响肿瘤细胞周期。 Akao 等报道了另外两种肉桂酸的衍生物 drupanin、Baccharin 对结肠癌细胞、胃癌细胞、白血病细胞的抑制活性。浓度为150 μmol·L-1时，它们对以上所有细胞均有显著抑制作用，抑制效果为 artepillin C＞Baccharin＞drupanin。从试验结果推测出该类化合物苯环上3位异戊二烯基团有助于抗肿瘤活性。但 Drupanin 似乎体现了比artepillin C 更小的副作用，对于Con-A诱导的人正常血中淋巴细胞的细胞毒作用，Drupanin 要弱于Artepillin C。 3 黄酮类化合物 蜂胶中对肿瘤起作用的黄酮类化合物主要是黄酮及黄酮醇类、二氢黄酮及二氢黄酮醇类化合物，这些物质对致癌物有抑制作用。试验中用抗微核实验模型对一些黄酮和黄酮醇衍生物进行筛选，发现大多数黄酮醇有抗苯并花的作用，其中高良姜黄素活性最强。蜂胶中的芦丁、桑黄素、槲皮素均能抑制苯并芘对小鼠皮肤的致癌作用；芹黄素、山奈酚、槲皮素对黄曲霉素B1与DNA加合物的形成有抑制作用，并能明显抑制对二甲基苯并蒽诱导的小鼠皮肤癌作用；槲皮素对TPA、3-甲基胆恿、N-甲基-N-亚硝基脂等引起的皮肤癌也有抑制作用。 Kyung 等的实验发现蜂胶中的Chrysin(白杨素)能够诱导人白血病细胞U937细胞凋亡，并阐明了机理。在U937细胞中，如使用PI3K抑制剂，抑制了Akt的磷酸化，就会发现增强了Chrysin的诱导凋亡作用；而如果Akt的过度表达，则会抑制Chrysin诱导肿瘤细胞凋亡。提示了Akt信号途径在chrysin诱导人白血病细胞凋亡过程中起着重要作用，即有可能是建立了ChrYsin和P13K从kt-相关的通路之间的连接。这对恶性血液疾病提供了一个新的治疗策略。还有研究表明Chrysin能够显著下调NF-IL6，抑制了NF-IL6与DNA的结合，抑制和阻断癌基因表达。Chen等从台湾蜂胶中分离到三种新异戊二烯基黄酮，Propolin A、B、C。Propolin A和B对3个癌细胞系的都显示了细胞毒性，DNA含量和DNA片段分析，Propolin A 有效地诱导癌细胞凋亡，并表现出强力的抗大部分自由基的消除作用。Propolin C对于人黑色素瘤细胞也观察到细胞毒作用(IC50为8.5 μmol·L-1)，能够剂量或时间依赖性地降低几种能够引起人黑色素瘤细胞凋亡的蛋白的水平如Procaspase-8，Bid蛋白、procaspase-3，而且能使细胞色素C从线粒体释放到细胞浆中，提示了Propolin C的细胞毒作用是由线粒体介导。 4 双萜烯酸类化合物 试验用高效液相色谱从巴西蜂胶甲醇提取液中分离出一种抗肿瘤物质，定性为新clerodane二萜烯(PMS-1)，分子式C20H32O3；(分子量320)。该化合物能够抑制DNA的合成减少皮肤癌的发生率，并且通过降低DNA的合成抑制肿瘤的生长。日本研究人员根据对人肝细胞癌细胞毒性的检验，从巴西蜂胶甲醇提取液中分离出两个clerodane双萜异构体，分别为15-氧代-3，13Z-kolavadien-17-含氧酸和15-氧代-3z-13E-kolavadien-17-含氧酸。 5 苯并吡喃类 Luo 从巴西蜂胶中分离出活性成分苯并-Y-毗喃衍生物PM-3，能够抑制人胸腺癌MCF-7细胞生长。在G1阶段用PM-3处理MCF-7细胞，结果导致细胞周期蛋白D1和E蛋白水平的降低，PM-3也抑制了转录水平上的细胞周期蛋白D1的表达。从巴西蜂胶分离出（Z）-2，2-甲基-8-(3-甲基-2-丁基)-苯并吡喃-6-丙烯酸(A)和(E)-2，2-甲基-8-(3-甲基-2-丁基)-苯并吡喃-6-丙烯酸(B)。在紫外线(365 nm)照射下B迅速变成A，也观察到相反的反应。反应从A或B开始，A和B的比率到达2.3，达到一个光稳定态。在抗人肺癌细胞HLC-20方面，A比B的细胞毒性强7倍。 蜂胶的抗肿瘤作用早已为人所知，但是一些研究报道值得注意。乌拉圭蜂胶的乙醇提取物是乳腺癌的一种抑制剂，而巴西蜂胶的水提取物和乙醇提取物对乳腺癌影响不大。说明蜂胶的来源和制备对于抑制肿瘤非常重要。还有报道，在成年大鼠抗艾氏癌实验中，蜂胶醇提液与博来霉素合用时的大鼠存活率要低于二者单独使用时的存活率。 近十年来，蜂胶以及其中的抗肿瘤活性成分的研究取得了巨大进展。不少效果良好的抗肿瘤成分成分结构新颖、有药用前途的先导化合物。我国是世界上养蜂和蜂产品生产大国，蜂胶资源丰富，随着对蜂胶抗肿瘤作用及其作用机理的不断深入研究，蜂胶在征服癌症中必将发挥应有的作用。
