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标题: 美医生发明新技术或将杀灭HIV病毒 [打印本页]

作者: 肝膽相照 时间: 2010-3-31 23:46 标题: 美医生发明新技术或将杀灭HIV病毒

本帖最后由风雨不动于 2012-4-14 16:41 编辑

网易探索3月31日报道据《科学美国人》杂志报道，一系列富有希望的化合物能够严重损害所有包膜病毒入侵细胞的能力，同时能够避免任何使传统抗病毒药物无效的抗药性。不过这些功效在实验室外还会有效吗？

班奥·李（Benhur Lee）可能已经发现了一种医学新技术，这种新技术能够使遍布全世界的艾滋病病毒（HIV），来自非洲的伊波拉病毒（Ebola），常见的流感病毒以及可能地球上每一种有包膜的病毒失去功效。而且一个额外的收获是这些病毒可能都无法对这种化合物发展出抗药性。

如果你觉得这太令人震惊了，以至于都怀疑它不是真的，那么你并不是唯一一个这么想的人。李首先对他自己产生了怀疑，同时这也是为什么在他的第一篇论文发表前，他在加州大学洛杉矶分校（UCLA）的实验室和遍布全美国的合作者一共进行了长达四年的细致研究工作的原因；关于这项潜在的革命性发现的论文，于2月16日发表在《美国国家科学院院刊》（PNAS）上。

李是病毒包膜方面的一位专家，病毒包膜是使病毒附着在细胞上的动态外表面，然后病毒包膜改变细胞的形状使病毒进入并感染这个细胞。这项研究最初是作为美国国家卫生研究所（NIH）提供的一项生物防御研究基金的一部分启动的，考察了一个包含3万种化合物的数据库中每种化合物对抗尼帕病毒（Nipah virus）包膜的效果，尼帕病毒是1999年在马来西亚首次发现的新兴感染症。

尼帕病毒是如此致命，以至于研究这种病毒只能在四级生物安全实验室（BSL-4）中进行，这种级别的实验室里研究者紧紧穿着密封的灾难应急套装，这种套装还带有内部氧气供应装置。这些实验室处于最高安全级别。在美国实验室只有4个安全级别。

李通过培育杂交病毒来应付这种高危险性的局面。他剥除了覆盖在相对温和的水泡性口炎病毒（VSV）表面的包膜，同时将致命性的尼帕病毒包膜注入到水泡性口炎病毒的核中。这使得他能够在位于UCLA的实验室中以低得多的BLS-2安全标准去考察那些化合物，看看那些化合物是否能够阻止病毒进入细胞。

“一种化合物（LJ001）的效果看起来非常好，1微克分子（1微克=10-6克）浓度中含有一个IC50（50%抑制浓度），这意味着它在一个低浓度条件下就阻止了病毒，这个效果对于初次考察而言是不错的。最重要的是，这种化合物对细胞培养物而言没有毒性，”李解释说。

迈克·沃尔夫（Mike Wolf），该实验室的一名研究生，想确认这种化合物对尼帕病毒的特异性，于是他还考察了LJ001抵抗VSV的情况（如果对VSV无效，即对尼帕病毒具有特异性）。当发现VSV实验条件下的抑制曲线与尼帕病毒实验条件下的曲线完全相同时，他起初非常失望，因为这项研究的基金是基于探究尼帕病毒的潜在疗法的（如今发现这种化合物对尼帕病毒没有特异性，即没有达到这项研究的初衷）。

然而，李鼓励他要更执着，保持更强的好奇心。在一系列的研究确认了这种化合物的效果和无毒性后，李将一份化合物和一份控制条件的双盲样本送到了得克萨斯大学加尔维斯敦医学部（University of Texas Medical Branch at Galveston）一个BSL-4实验室里的同事那里（双盲样本，这里指李和这位同事都不知道两个样本哪一个是化合物哪一个是控制组，这样可以消除实验者主观意志的影响），这位同事分别测试了两个样本抵抗尼帕病毒、伊波拉病毒和其他病毒的情况。当发现LJ001阻止了上述所有病毒侵入细胞时，他们震惊了。

于是李通过使用它抵抗艾滋病病毒，来看看它的缺陷。他过去曾广泛研究过艾滋病病毒——现在仍然还在研究。“这对病原体学家而言根本毫无意义，因为逆转录病毒（艾滋病病毒）与类似尼帕病毒和伊波拉病毒这样的负链RNA病毒毫无相同之处，”他说。

“我们开始仔细考察一个包含20多种病毒的病毒系列，”LJ001阻止了所有那些病毒侵入细胞。“我当时对到底发生了什么一无所知，我无法找出那些病毒的任何相同之处。”最终，当他测试这种化合物抵抗腺病毒（adenovirus）的情况时，LJ001终于失效了。直到这时他才找出这种化合物的通用性：LJ001仅对脂质包膜病毒有效。为了排除这种化合物所能够阻止的病毒的边界或融合过程（在这个边界外病毒刚好能够侵入细胞）的可能性，研究者花费了好几年时间。

李表明这种化合物能够同时与病毒和被入侵细胞的包膜上的脂质绑定。最后他开始认识到它同时对病毒和被入侵细胞两种有机体造成了损害。对两者造成损害的不同之处在于，较大的细胞（与病毒相比）有能力修复各种各样定期发生的损害；而病毒则不能。不过，更原始的病毒甚至根本不带有修复机制；一种新的病毒粒子（完整的病毒）在被感染细胞长出细胞膜时，通过逐渐撕去细胞膜来为其包膜获取脂质。一旦病毒脂质被LJ001消耗殆尽时，病毒就永远被消灭了。

目前的抗病毒药物将解码的蛋白质视为病毒生命周期中最重要的目标，同时不同病毒类型之间药物的差异很大，一种专门为某种病毒定制的特异性药物很少能够对一种以上的病毒有效。此外，主动的活动进程使病毒不可避免地发展出对这些药物的抗药性。为弥补这一缺陷，联合疗法试图同时在多个位置攻击病毒，这使得病毒无法发展出抗药性。

不过，病毒无法像对其蛋白质进行基因控制那样，对脂质进行基因控制。所以，李对病毒发展出对类似LJ001这样药物的抗药性保持乐观。他说，“我无法想象病毒如何能够发展出对LJ001这样攻击其脂质（而非蛋白质）的药物的抗药性。”

当UCLA的专利律师在专利数据库中搜索这类专利时，他们发现一家公司已经为LJ001申请了一项专利，该专利只宣称其具有抗病毒效果，而别无其他说明。李并不担心；他的同事迈克尔·荣格（Michael Jung），一位UCLA的药物化学家，已经完善了原始的化合物，并且从中发现了100多份药物变体的专利。目前加州大学洛杉矶分校正在申请对这些专利的所有权。李说最重要的是证明这些药物在人体体内的功效。他正在进行研究试图克服一些他们已经确定的障碍，同时他正准备允许一组具有专业知识的专家将该药物的产品推向市场。他最主要的关注点是基础研究，同时他已经在考虑研究中的下一个重大挑战了。

沃纳·格林（Warner Greene），加州大学旧金山分校格莱斯顿病毒学与免疫学研究所主任，为李和他的合作者“为这项意外的发现所进行的十分吸引人的工作”感到高兴。不过，他同时告诫说，“从能够实际应用于治疗的角度来看，这还只是一项非常，非常早期的实验室发现。”

“抗病毒效果的范围十分吸引人，不过我担心由于细胞膜破坏的根本机制，与现在大加赞赏的无毒性相比，未来可能会发展出大量的毒性。原发细胞往往比实验室培养的细胞具有更强的敏感性，”格林说。

他补充道：“拥有这种药物，不管手术切口处的细胞是否能够追上（药物损害细胞的速度）或者细胞是否能够保持活性，只要还处于药物仍然能够高效抵抗病毒的时间内，你总是可以在这个切口里进行手术。所以这将是一场比赛。”这也是目前很多癌症疗法背后的共同准则。

本文译自/科学美国人编译/易言译言供网易探索独家稿件未经许可请勿转载。

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作者: freshnail 时间: 2010-3-31 23:46

作者: freshnail 时间: 2010-3-31 23:57 标题: 是这篇文章吗？

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作者: 特深沉 时间: 2010-4-1 02:07

至少要等到动物实验阶段，才能估计效果和毒性。

作者: MAgou 时间: 2010-4-1 04:09

提示: 作者被禁止或删除内容自动屏蔽

作者: hunterpt 时间: 2010-4-1 07:40

留贴关注中。。。。

作者: hunterpt 时间: 2010-4-1 07:47

再留言一下太神奇了！！！

作者: stevenvai 时间: 2010-4-1 08:22

看来蔡教授的药还是不能和人家比

作者: 乡之梦 时间: 2010-4-1 09:13

HBV是脂质包膜病毒吗?
真是个好消息啊!

作者: 虎豆 时间: 2010-4-1 09:26

作者: lzwp 时间: 2010-4-1 09:43

作者: 富贵数字 时间: 2010-4-1 09:50

又一个发现~

作者: lovemymother 时间: 2010-4-1 10:51

鄙视盗版！

作者: 肝胆相照009 时间: 2010-4-1 10:56

美国人救咱们来了，大家挺住，呵呵

作者: 走遍四方 时间: 2010-4-1 11:53

作者: mingbai 时间: 2010-4-1 17:44

从实验室到临床，还有很长的路要走，很多新药在实验室有效，用到人体就无效了。记得很久之前一对兄弟发现了干细胞培养方法，并获得诺贝尔奖，据说可以根治糖尿病、帕金训症，结果到现在连个影都没有

作者: 齐欢畅2 时间: 2010-4-1 18:08

原帖由 mingbai 于 2010-4-1 17:44 发表
从实验室到临床，还有很长的路要走，很多新药在实验室有效，用到人体就无效了。记得很久之前一对兄弟发现了干细胞培养方法，并获得诺贝尔奖，据说可以根治糖尿病、帕金训症，结果到现在连个影都没有 ...

那个还是比较难的，但药物开发中，青霉素的例子说明，某种药物的开发可能源于偶然。

作者: 富贵数字 时间: 2010-4-1 18:42

原帖由 mingbai 于 2010-4-1 17:44 发表
从实验室到临床，还有很长的路要走，很多新药在实验室有效，用到人体就无效了。记得很久之前一对兄弟发现了干细胞培养方法，并获得诺贝尔奖，据说可以根治糖尿病、帕金训症，结果到现在连个影都没有 ...

那就是发明过于松懈了，一点点成就就感到很好了, 没去临床的说什么都没用

作者: 肝胆相照009 时间: 2010-4-1 19:13

原帖由 齐欢畅2 于 2010-4-1 18:08 发表

那个还是比较难的，但药物开发中，青霉素的例子说明，某种药物的开发可能源于偶然。

理论是指导实践的基础，至少是发明了新技术，有指导意义！寄希望于偶然只能是大海捞针，一个字---难。。

作者: 走遍四方 时间: 2010-4-2 09:06

披荆斩棘勇往直前探索不止终有所成

作者: imusm 时间: 2010-4-2 09:25

用杀的,总是两败俱伤,杀死病毒的同时,人也没了.这条路不通的.

作者: 疯一点好 时间: 2010-4-2 11:01

不管是否真假、不管还要多长时间、不管有效率如何，我每天最希望看到的就是这样的消息，感谢战友们的辛勤劳动，盼望尽快有终结乙肝方法。

作者: yigana 时间: 2010-4-6 20:41

这么多人帖子不看清楚就回复的？HIV是什么不懂吗？内容都没看，就瞎回复瞎幻想！

作者: 疯一点好 时间: 2010-4-8 17:44

如果能治愈HIV那么治疗HBV也就有很大希望了，现在的抗乙肝病毒药物（核苷（酸）类）都是治疗HIV的药物。

作者: 齐欢畅2 时间: 2010-4-8 20:39

包膜型

帶狀皰疹病毒的電鏡負染照片顯示其病毒顆粒周圍被包膜所環繞。一些病毒可以利用改造後的宿主的細胞膜（來自細胞表面的質膜或細胞內部的膜，如核膜及內質網膜）環繞在病毒體周圍，形成一層脂質的包膜。包膜上既鑲嵌有來自宿主的膜蛋白也有來自病毒基因組編碼的膜蛋白；而脂質膜本身和其中的糖類則都來自宿主細胞。包膜型病毒位於包膜內的病毒體可以是螺旋形或正二十面體形的。[62]

無包膜的病毒在宿主細胞內完成複製後，需要宿主細胞死亡並裂解後，才能逸出並進一步感染其他細胞。這種方法雖然簡單，但常常造成大量非成熟細胞死亡，反而降低了對宿主細胞的利用率。而有了包膜之後，病毒可以通過包膜與宿主的細胞膜融合來出入細胞，而不需要造成細胞死亡。[62] 流感病毒和愛滋病毒就採用的是這種策略。大多數的包膜型病毒的感染性都依賴於包膜。[65]

作者: 齐欢畅2 时间: 2010-4-8 20:43

结构
[编辑] 外壳
也称为病毒的外衣壳。相当于一般病毒的包膜。由脂质双层和蛋白质组成。脂质双层内含有乙肝表面抗原（HBsAg），分别是S抗原、前S1和前S2抗原，它们一起又构成了外壳上大、中、小三种蛋白形式。

[编辑] 核心
分为外部的衣壳和内部双链DNA。衣壳由乙肝病毒的核心抗原（HBcAg）组成，呈二十面体对称，直径为27纳米，也称为内衣壳。DNA上还带有DNA多聚酶。DNA呈环状并且有缺口，大约含有约3200个核苷酸。DNA两链长短不一，长链完整，长度恒定，为负链。短链是正链，长度可变，大概是长链的50％~80%。 DNA的功能是编码表面抗原，核心抗原，和DNA多聚酶。

[编辑] 形态
在电子显微镜下，可以发现，乙肝病毒有三种形态，分别是大球形颗粒、小球形颗粒和管形颗粒。大球形颗粒就是Dane 颗粒。小形球颗粒，直径大约22纳米，是乙肝病毒感染后血液中最多见的一种。它由表面抗原组成，并不含有乙肝病毒的DNA以及DNA聚合酶。管形颗粒，直径也约为22纳米，长度在50~70纳米之间。实际上是由几个小球形颗粒聚合在一起而成，但同样具有HBsAg的抗原性。

[编辑] 病毒的复制
病毒进入肝细胞后，脱去衣壳，DNA进入肝细胞核。
正链DNA在DNA多聚酶的作用下，以负链为模版，延长修补成完整状态。
双股DNA形成闭环超螺旋。在细胞RNA多聚酶催化下，以负链DNA转录成长短不一的RNA。短的RNA仅作为信使RNA，长的还是前基因组RNA。
从信使RNA翻译出e抗原，合心抗原，DNA多聚酶，和三种表面抗原。合心抗原组装成内衣壳。
前基因组和DNA多聚酶进入组装好的病毒内衣壳中。
在DNA多聚酶（逆转录酶）的作用下，以前基因组RNA为模版，逆转录为负链DNA。而前基因组则被降解消失。
以负链DNA为模版，复制生成正链DNA。
含有双链DNA的内衣壳裹上外衣壳，成为病毒体。从肝细胞浆释放至肝细胞外。
[编辑] 抗原
表面抗原
核心抗原
e抗原
[编辑] 参考文献
季晓辉张建瑶主编《医学免疫学与医学微生物学》科学出版社 ISBN 7-03-009469-7

[编辑] 链接
剥开乙肝病毒

来自“http://zh.wikipedia.org/wiki/%E4 ... E%E7%97%85%E6%AF%92”

作者: 齐欢畅2 时间: 2010-4-8 20:53

病毒粒子的胞膜化过程

嗜肝病毒的成熟核壳定位于细胞质，随后发生的包膜化过程很难通过电子显微镜等手段直接进行观察，因此，病毒病毒粒子获取其包膜的机制尚不清楚。虽然HBV包膜对温和型去污剂敏感，对于病毒包膜中是否含有脂质仍不清楚。至今为止，只是证明在20nm的HBsAg亚病毒颗粒中含有脂质。但通过与其他包膜病毒的比较以及对嗜肝病毒粒子形成在分子水平上的分析，可以推测HBV病毒粒子是由病毒粒子在细胞内膜进行常规的出芽所形成。

Post-ER、pre-Golgi膜的某些位点具病毒包膜蛋白，可能是病毒出芽所在地,但病毒病毒粒子如何转运至这些位点尚不清楚。在DHBV中，含dsDNA和非高度磷酸化的核心蛋白的成熟病毒粒子可与膜结合，该过程不依赖病毒包膜蛋白。不成熟、高度磷酸化且含ssDNA的病毒粒子则不能与膜结合。这些现象表明，出芽过程中成熟病毒粒子与不成熟病毒粒子的筛选不是靠病毒粒子与包膜蛋白的相互作用，而是依赖病毒粒子与膜的相互作用，且成熟病毒粒子可在膜上侧向运动至出芽位点。

最近有报道称，一些包膜病毒的结构蛋白具所谓的late 结构域，在出芽过程中参与与宿主因子的相互作用。通过这种相互作用，病毒得以接近宿主出芽装置。HBV C蛋白在病毒粒子表面有一序列PPAY（129-132位氨基酸），符合已知的late 结构域的序列PPXY。将129、130和132位的残基突变成丙氨酸会阻断HBV病毒粒子形成，而131位残基的突变则对病毒病毒粒子或病毒粒子的形成没有任何影响，因此还不能确定这些残基在出芽过程中是否具有直接的重要的作用，还需要设计更多的实验来确定HBV是否利用late 结构域介导途径出芽。

HBV病毒粒子的包膜化依赖病毒包膜蛋白。与C型反转录病毒或慢病毒（lentivirus）不同，阻断包膜蛋白表达的HBV突变体不能释放脂双层包裹的病毒粒子。在一个不能表达M蛋白的患者身上确认，一个HBV自然点突变表明M蛋白不是必须的。而L或S蛋白表达被抑制则会阻断病毒粒子的形成，这些结果表明：（i）L和S蛋白异源多聚物的形成（也可和M蛋白一起）会导致亚病毒颗粒出芽被抑制，同时，因L蛋白对分泌的抑制作用，S蛋白也滞留在细胞内膜。（ii）病毒病毒粒子可解除对分泌作用的阻断。（iii）包膜化过程由S蛋白的出芽能力所主导。但是，N端截短的L蛋白突变体能与野生型L蛋白一样有效的形成病毒粒子。另外，20nm HBsAg亚病毒颗粒的出芽机制能在多大程度上反映病毒粒子的出芽过程也还不清楚。

对L蛋白在病毒粒子形成中的功能的一点提示来自该蛋白的跨膜拓扑学结构。在L蛋白的N端融合分泌信号，从而只产生一种跨膜拓扑学结构的L蛋白，将前体S结构域转移至ER腔（e-preS）。该L融合蛋白能被组装进入亚病毒颗粒但不能形成病毒粒子。亚病毒颗粒的形成和分泌可作为HBV包膜蛋白正确折叠和参与病毒粒子形成的指标。L蛋白将前体S结构域暴露在ER胞质一侧（i-preS）对于核壳的包膜化非常重要。表明L蛋白前体S结构域含有一些区域能介导与病毒粒子的联系。与i-preS结构域具基质蛋白功能相一致，胞质内DHBV病毒粒子的细胞内途径受DHBV L蛋白的影响。当L蛋白不存在时，病毒粒子将进入细胞核，将其基因组释放至核质；当L蛋白表达达到一定的阈值，病毒粒子将以有包膜的病毒粒子形式被释放。DHBV L蛋白的这个功能可归于161个氨基酸长的前体S结构域的116-137位氨基酸。HBV的 i-preS中也发现了一个短的类似的区域103至124位氨基酸（或92-113位氨基酸，与病毒基因型有关）。该区域的小氨基酸的替换会阻断病毒粒子的形成，但L蛋白仍能被组装进入亚病毒颗粒，甚至连更细微的突变如将两个相邻的氨基酸换成丙氨酸，也会阻断核壳的包膜化。但该结构域的上游区域可被缺失，而不影响病毒粒子的形成；下游的大多数区域直至S结构域内II型信号的跨膜区的突变也没有任何影响。

第二个暴露在ER胞质一侧的包膜蛋白结构域是S蛋白跨膜区的环状结构。遗传学分析显示该环靠近C端的一半区域内的短片断的缺失会抑制病毒粒子的形成，但不抑制20nm亚病毒颗粒的形成，但该区域内的点突变不具这种效应。在没有微粒体存在时，进行体外的N端或C端截短的L蛋白与E.coli来源的病毒病毒粒子的体外结合实验。实验表明，L蛋白的两个片段（一个从24至191位氨基酸；一个从191至322位氨基酸）在病毒粒子的结合中具有协同作用。因此，我们推测在出芽时上述两个片段或其中的一个作为基质结构域直接与病毒病毒粒子结合，这类似于α病毒E2蛋白的胞质尾在粒子形成中的作用。

通过突变体分析，对病毒粒子上可能的结合位点进行了定位。对核心蛋白随机插入和缺失突变体的初步筛选确定了一些突变体，他们均能完成前体基因组的包装、病毒粒子的组装和病毒DNA的合成，但会阻断核壳的包膜化，相似的表型在分离自慢性病毒携带者的自然发生HBV突变体中也有发现。在基于HBV病毒粒子晶体结构的更深层次的筛选中，52个暴露在病毒粒子表面的氨基酸被换成丙氨酸。11个突变体特异性引起核壳包膜化的缺失（图.2），它们成簇地定位在突触的基部或突触之间的凹处。突触中间区域或顶部的突变则没有影响。但是，HBV从转染细胞中的出芽可被一个经肽库筛选所得的多肽所抑制，且该多肽能与突触顶部结合。可能这种抑制效应是由空间障碍所引起，而不是由于包膜与病毒粒子间特异性相互作用被阻断。

人们认为包膜蛋白的其中一个或两个基质结构域可直接与病毒粒子表面的一个或两个结构域结合，这点在HBV的一个双重突变体中得到了证实。在该突变体中，核心基因I97L突变会引起相对未成熟的病毒粒子包膜化，而L蛋白基质结构域内A119F突变可抑制I97L的突变效应。另外，来自HBV包膜蛋白和病毒粒子的多肽的体外结合实验也同样证实了这点。在体外结合实验中，肝组织来源的病毒病毒粒子和重组病毒粒子都能与对应于L和S蛋白基质结构域的多肽较好的结合，这表明病毒粒子与包膜蛋白的相互作用可能并不能区分成熟和未成熟的病毒粒子。

在描述20nm亚病毒颗粒形成的章节中有提到：嗜肝病毒包膜蛋白的组装过程具有选择性，尚没有发现任何的外源蛋白被组装进亚病毒颗粒，即便是禽类或哺乳类来源的包膜蛋白也不能混合组装。这在病毒粒子的包膜中也是一致的。WHV的L蛋白可以代替HBV L蛋白参与HBV病毒粒子的形成尽管效率较低，而DHBV 的L蛋白则不行。这与WHV比DHBV在L蛋白基质结构域上与HBV具有更高同源性的事实相符合。不过，通过融合S蛋白N端将外源结构域组装进HBV包膜是可行的。另外，需将分泌信号融合在蛋白N端以确保外源结构域被转运至ER腔。所产生蛋白的构象与用外源序列取代前体S2结构域的M蛋白构象相似。该融合体与HBV在细胞系中的共表达可产生表型混合的病毒，并将外源结构域暴露在病毒粒子表面。

一种被称为丁型肝炎（HDV或delta virus）的缺损病毒可增殖性感染仅HBV感染的肝细胞，因为HDV可利用HBV的包膜。HDV核壳由一环状ssRNA和HDV编码的具长短两种形式的蛋白组成（delta 抗原），环状ssRNA因为分子本身可以互补配对而具双链构象。球形核壳的结构尚哺清楚，较长delta 抗原在C端比短的delta抗原多19个氨基酸，且在该区域含异戊二烯化（isoprenylation）信号。异戊二烯化对于HDV核壳的包膜化很重要。与HBV病毒粒子形成过程不同，在HDV病毒粒子形成过程中，HBV 的S蛋白很充足。L蛋白对于HDV的感染是必须的。这些结果表明HDV和HBV病毒粒子包膜化的分子机制是不同的，尽管它们利用相同的包膜蛋白。

作者: 走遍四方 时间: 2010-4-16 16:57

作者: 病不孤独 时间: 2010-4-16 17:03

我们要做的是，放好心态，保重好自己，安静等待。

作者: 走遍四方 时间: 2010-4-16 17:06

还有不能熬夜

作者: 东海岸 时间: 2010-4-16 18:43

披荆斩棘勇往直前探索不止终有所成

作者: jimth 时间: 2010-4-17 08:12

原帖由 东海岸 于 2010-4-16 18:43 发表
披荆斩棘勇往直前探索不止终有所成

希望中啊...........

作者: xiaomao558 时间: 2010-4-19 20:11

科学家们加油

作者: vin31 时间: 2010-4-21 07:22

就在眼前

作者: 战胜无敌 时间: 2010-4-23 22:34

作者: 一定转阴 时间: 2010-4-23 23:17

作者: wp111 时间: 2010-4-24 08:31

希望啊！！！！！

作者: 战胜无敌 时间: 2010-4-28 16:38

这么好的技术继续关注

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