肝胆相照论坛

标题: 如果基因治疗能够彻底根除乙肝，大家能够接受多少？ [打印本页]

作者: lifflefield 时间: 2011-9-25 21:38 标题: 如果基因治疗能够彻底根除乙肝，大家能够接受多少？

小弟有意向和国内的一些大医院，进行乙肝HBV的治疗合作研究，我的主要工作是研究艾滋病毒和乙肝，丙肝病毒。乙肝在国外，临床的实验很难找到样本，具体案例很难得到第一首资料。而，国内由于群体居多，所以合作是一个大方向。我的基本治疗方案是：基因治疗 gene therapy，先想听听各位的建议，大家对国际流行的基因治疗的看法和态度。
为什么要用基因治疗： 1. 因为市面上所有的药物，只能控制乙肝，而非杀死乙肝，就像门外的强盗，被你锁在外面，那些药物是门，而强盗越聚越多，迟早会破门而入，所以，这些药物只是控制作用，最终人体还是被乙肝病毒战胜了。 2. 干扰素，它是简介杀死病毒的细胞因子，而非直接和病毒作用的药物，疗效不是最好，有一定无效期，而且因人而异。
我们组的研究成果，是细胞内K因子是直接杀死乙型肝炎病毒的，包括隐藏在细胞核内的cccDNA和前体RNA（pregenome RNA）。所以，我们想设计基因治疗，用无害的载体病毒，将k因子携带入人体肝脏，一旦成功，肝脏细胞就像自身有了武器一样，终身足部杀死乙肝病毒，最终彻底清除乙肝病毒在体内。
这种治疗的缺点是：1.我们必须用所谓的病毒治疗乙肝病毒。2。携带k因子的病毒能否高效的侵染肝脏优点是：1.患者不用服药，终身携带k因子 2.彻底清除乙肝病毒，避免癌变的可能性。
综上实验，在老鼠上已经初步成功，下一步想进入临床实验阶段，所以我的问题：乙肝患者，多数都能很好的生活，并且在20－30年内不见得有生命的威胁，而对于基因治疗这种，将携带k因子的无害病毒，在体外培养，并注射进入腹腔肝脏杀死乙肝病毒，有多大的接受能力？？当然，对艾滋病患或者癌症，他们多数是接受此方法的，所以这种疗法在这两个领域进展的非常快。乙型肝炎，如果用这种方法，只有一个最大的优势：就是清除乙肝病毒！让人体免受乙肝病毒长期的毒害。有些国内专家对我直言：对于国内的患者，只要有药物控制，他们并不需要复杂的基因治疗，我也能非常理解，但是如果这样，基因治疗在乙肝领域进展将非常缓慢。
我一直比较矛盾就在于：找到了能够彻底清除乙肝病毒的因子，而治疗手法必须目前是基因治疗？？大家如何看待这个问题，是否值得投入更多研究在，乙肝的基因治疗方面，多谢明言。
（对于设计生产类似k因子的药物，我觉得有难度，如果有这类药物，那真是非常完美，但是k因子比较大，药物很难模仿k因子的杀伤效力，我估计10-20年，也未必能够设计出良好的类似k的药物。）

作者: 虎戏青云 时间: 2011-9-25 22:18

楼主观点好像很深奥，我不太会理解，但我想问，其实乙肝病毒侵入人体细胞，对人体并无很大害处，而是人体免疫功能识别病毒，进而杀死染病细胞，所以会造成肝脏坏死，而楼主所谓用一种无害病毒进入细胞消灭乙肝病毒细胞，那我们的免疫细胞同样不愿意与这种新的无害病毒和平相处，是不是免疫系统依然会杀死感染这种新无害病毒的肝细胞而造成肝脏坏死？

作者: StephenW 时间: 2011-9-25 22:41

本帖最后由 StephenW 于 2011-9-25 22:56 编辑

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请你能否解释一下，什么是“k因子”?

作者: lingmaigui 时间: 2011-9-25 22:54

看不懂，捧个人场

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 00:00

本帖最后由 lifflefield 于 2011-9-26 00:13 编辑

StephenW 发表于 2011-9-25 22:41
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请你能否解释一下，什么是“k因子”?

好的。 HBV的基本生活史：细胞核内的cccDNA－－－》RNA－－（通过HBV聚合酶）－－－》细胞质内的HBV DNA。市面上所有的核苷酸类似药物都是通过结合HBV聚合酶，而不让它与HBV 自己的RNA结合，来控制HBV 子代DNA的生产。所以，HBV的RNA依然大量存在，只是在药物的作用下，暂时不能结合到HBV聚合酶上。一旦停药，HBV RNA就会疯狂的通过聚合酶生成大量的子代DNA，也是所谓的停药后的反弹。 1 细胞质内，k因子本身不杀伤HBV RNA，这么说，细胞内是不允许任何聚合酶和RNA结合的，（结合只能在细胞核内），而k因子就是识别一旦HBV聚合酶跟HBV RNA结合之后，K自己就共同结合他们身上，而k自己能够结合大量的RNA酶类，k就把细胞内许多RNA酶类引导HBV RNA上，这样HBV的RNA就被一一降解。降解之后的RNA的结果，就是各种蛋白质，HBe，HBc还有DNA都减少。因为HBV RNA是他们的上游，这是最新的细胞内抗病毒RNA逆转录的机制。我们自己正常的RNA，不会结合聚合酶，它们只会翻译成蛋白质，而病毒RNA会逆生成DNA，这就是细胞如何识别病毒RNA和细胞自己RNA的免疫机制。
2. 细胞核内，k因子能够专一引起HBV cccDNA降解，也是通过结合一些酶类，具体比较抽象。而HBV cccDNA一般也就是10-50分子在细胞核内，很容易被降解。
也许你们会问：那么为什么乙肝没有被我们的k因子被杀死。我来解释一下

你们所知道的干扰素，（IFN），包括TGF等等，都是可以引起K因子的增加的，也就是不确切讲，干扰素，就是通过引起k上升而杀死乙肝病毒。我想大家明白了吧，但是k的过多存在，会引起免疫炎症，对人体有害，所以，干扰素只能上调一定量的k因子，就不再加码了。这是细胞生理过程。
而我们怎么做呢？我们在用基因的方法，改造了k因子，让它们不再对人体有害，而只降解乙肝病毒分子。
K因子是一个200个氨基酸的蛋白质，我们只能用基因治疗的方式将改造过的它在肝细胞存在，它就能专一降解所有RNA，即使对药物有抗性的乙肝病毒，一样被杀死。但是，这个k需要导入肝脏细胞，需要很多研究，目前点，就是如何导入。导入方法是借鉴艾滋病和癌症的治疗方式，也就是非治病病毒导入

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 00:10

本帖最后由 lifflefield 于 2011-9-26 00:16 编辑

虎戏青云发表于 2011-9-25 22:18
楼主观点好像很深奥，我不太会理解，但我想问，其实乙肝病毒侵入人体细胞，对人体并无很大害处，而是人体免 ...

其实乙肝病毒侵入人体细胞，对人体并无很大害处，而是人体免疫功能识别病毒，进而杀死染病细胞，所以会造成肝脏坏死，

－－－－－－－－－－－－

这不对的，乙肝病毒入侵，如果没有免疫功能，病毒大量爆发，人就要死亡。而是有了免疫功能不断的攻击受感染的肝脏细胞，虽然造成肝脏组织纤维化或者坏死，但是人活着，这是一种妥协的艺术。

同样不愿意与这种新的无害病毒和平相处，是不是免疫系统依然会杀死感染这种新无害病毒的肝细胞而造成肝脏坏死？

－－－－－－－－－－－－－

你的理解点非常好啊。我告诉你不会的。这种无害病毒，很多人自己身上都有，包括你自己也有可能有的，这种病毒为什么最近非常火，就是它没有致病性，甚至逃过免疫组织监控。有点共生的关西，它能够存在我们任何细胞里面，但是不发生任何病变。美国欧洲的临床上，已经用此病毒治疗好一些肿瘤病，至今没有见到它们副反应。也就是说这种无害病毒，10%以上的的人都携带，有点像肠道里面很多共生细菌似地。我们就是通过这个无害病毒，将k因子带入肝脏，杀死乙肝病毒的。当然，如果有一种药物能够取代k因子，那是完美的，但是很难开发，而我们组不是能够开发药物的，对于药物的设计没有研究。目前问题就是，如何导入k，到肝脏。理想的方案，是直接注射外援表达质粒DNA，进入肝脏，或者再用其他方法，这些都是一个途径我们最终目的，是导入改造过的K因子来彻底清除HBV

作者: StephenW 时间: 2011-9-26 00:20

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"K因子是一个200个氨基酸的蛋白质"
很抱歉，我无法找到任何有关k 因子。你有另外一个名字？

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 00:25

本帖最后由 lifflefield 于 2011-9-26 00:31 编辑

StephenW 发表于 2011-9-26 00:20
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"K因子是一个200个氨基酸的蛋白质"

是我暂时命名为k，它是RNA或者DNA结合蛋白质，它保守存在于灵长类动物，人类，鱼，鸡，鸟等等。它有一个兄弟家族，APOBEC，你可以去搜索一下 APOBEC3G吧，它非常有明，但它不是k

作者: StephenW 时间: 2011-9-26 00:44

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"乙肝病毒入侵，如果没有免疫功能，病毒大量爆发，人就要死亡" - 我不同意.
为什么"无害病毒" 不会"大量爆发，人就要死亡"?

作者: StephenW 时间: 2011-9-26 00:49

lifflefield 发表于 2011-9-26 00:25
是我暂时命名为k，它是RNA或者DNA结合蛋白质，它保守存在于灵长类动物，人类，鱼，鸡，鸟等等。它有一个兄 ...

为什么不考虑RNAi技术?

作者: foto2002 时间: 2011-9-26 01:46

of course , i will

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 08:30

StephenW 发表于 2011-9-26 00:44
回复 lifflefield 的帖子

"乙肝病毒入侵，如果没有免疫功能，病毒大量爆发，人就要死亡" - 我不同意.

该病毒rAAV，你可以去查一下国际国内，都是论证过许多年了。它是经过基因改造，只有一次侵染性，没有完整的病毒生活史，也就是不会产生病毒子代，它侵染肝细胞后，只会专一生产我们要的因子，而且它经过改造只会侵染肝细胞。
即使这个病毒不经过改造，它生产子代病毒，也没有致病性，就像人体的共生病毒似地（人体基因存在许许多多的共生病毒基因，我们叫做内源病毒）。

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 08:41

StephenW 发表于 2011-9-26 00:49
为什么不考虑RNAi技术?

RNAi技术从1996年被发现开始就被赋予有可能治疗各种疾病。包括一些研究室用RNAi技术证明了，可以拟制艾滋病毒在老鼠上复制。但是 RNAi技术最大问题是，如何导入细胞和人体，如果体外合成的RNA是很难导入体内，现在的RNAi技术紧紧停留在体外水平。现在仅有的
导入人体的技术，也是基因治疗的方法，也是用跟我相似的方法用，用非致病性病毒带入（或者其他载体），因为它是RNA，所以在细胞内含量很有问题。
最大的问题，是RNAi是可以设计专一杀伤HBV的RNA，但是对HBV没有扩大效应，对cccDNA更完全没有作用，而且大量的RNA存在于细胞中，会严重影响细胞工作。而蛋白质K最大的特点，就是多层次的杀伤HBV，包括cccDNA和RNA，甚至如果RNA逃过第一次的杀伤，K依然存在RNA上，阻止它生成DNA，同时k能够穿进HBV病毒颗粒内。
在基因治疗上，RNAi技术的弱点，就在于是RNA，而非蛋白质那样有多重功能和稳定性。但是，我们也可以双管其下，比如用病毒同时导入RNAi和k因子，但是关键点在于：是否1+1=2？而且，RNAi的导入比起蛋白质并不非常安全。

作者: 西安狂人 时间: 2011-9-26 10:44

很深奥不懂。。。。。关注中。。

作者: 西安狂人 时间: 2011-9-26 10:46

如果 k因子真的影响人体的免疫。如果潜伏期 > 50年很多人都无视。前提是必须根治 hbv dna

作者: 疯一点好 时间: 2011-9-26 11:37

“美国欧洲的临床上，已经用此病毒治疗好一些肿瘤病，至今没有见到它们副反应。”

请问他们的这些K病毒来源于什么？为什么人家都已经有这种病毒了，而我们还要10-20年啊？

作者: 走遍四方 时间: 2011-9-26 11:51

楼主你所说的K因子会存在于以下链接中的物质吗
http://www.hbvhbv.com/forum/thread-1079308-1-1.html

作者: 走遍四方 时间: 2011-9-26 11:59

病毒rAAV-----中文叫腺病毒吧。。。确实是人类利用病毒的突破。。。

作者: 南来飞鸿 时间: 2011-9-26 12:10

请楼主说明一下，如果顺利，你的这套方法，最快什么时候用于人体？你想我们怎么做？集体请求政府立项吗？

作者: StephenW 时间: 2011-9-26 12:59

本帖最后由 StephenW 于 2011-9-26 13:11 编辑

lifflefield 发表于 2011-9-26 08:30
该病毒rAAV，你可以去查一下国际国内，都是论证过许多年了。它是经过基因改造，只有一次侵染性，没有完整 ...

从Wikipedia
Adeno-associated virus (AAV) is a small virus which infects humans and some other primate species. AAV is not currently known to cause disease and consequently the virus causes a very mild immune response. AAV can infect both dividing and non-dividing cells and may incorporate its genome into that of the host cell. These features make AAV a very attractive candidate for creating viral vectors for gene therapy, and for the creation of isogenic human disease models.[1] Recent human clinical trials using AAV for gene therapy in the retina have shown promise.[2]
腺相关病毒（AAV）是细小病毒感染人类和一些其他的灵长类动物。不腺相关病毒是目前已知引起疾病，因此病毒引起的一种非常温和的免疫反应。腺相关病毒能够感染分裂和非分裂细胞，并可能纳入宿主细胞基因组。这些特性使的AAV病毒载体基因治疗创造一个非常有吸引力的候选人，并为创造等基因的人类疾病模型[1]最近的人类使用在视网膜基因治疗的腺相关病毒的临床试验显示的承诺。[2]

和你说是不同的.我知道有些病毒是无害的，这就是为什么我要告诉你，你关于HBV的概念是不正确的，并非所有病毒"大量爆发，人就要死亡".

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 13:13

走遍四方发表于 2011-9-26 11:51
楼主你所说的K因子会存在于以下链接中的物质吗
http://www.hbvhbv.com/forum/thread-1079308-1-1.html ...

完全不同。我所说的因子，相当于干扰素的下游分子，攻击HBV，是蛋白质。而你所描述的是药物。

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 13:22

StephenW 发表于 2011-9-26 12:59
从Wikipedia
Adeno-associated virus (AAV) is a small virus which infects humans and some other prima ...

我所说的，应该是我表示学术上最大的通俗性，所以势必有学术上的误差，因为这不是学术文章。改造过的rAAV病毒，已经在临床上应用于肿瘤病人，是病人，而不是动物，已经取得很大的成功，所以这个病毒给了promise，对基因治疗领域。
我前面所说的，都是改造过的rAAV病毒，并不是你理解的完整的rAAV病毒，我们破坏了rAAV病毒基因，让它携带k因子进入肝脏，而且rAAV病毒，被标记上了肝脏细胞的特异受体，所以它一旦投入人体，只能感染肝脏细胞，释放k因子，只有一次侵染。这个基因改造病毒，是在体外培养好的，并不需要人体培养，当培养好的改造过的rAAV病毒，进入肝脏，只做一次侵染，同时我们构建四环素调控抗生素，只有注射四环素，rAAV病毒才开始生成k因子，一旦病人体内乙肝病毒被清除干净后，停止服用四环素，rAAV病毒就会停止生产K因子。
你所查到的是天然rAAV病毒。
HBV可以理解为急性肝炎病毒，如果人体没有免疫力和应急因子，比如，体外培养的细胞，最终都是被大量的乙肝繁殖引起死亡的，而在体内，恰恰是免疫力赋予了人体对抗乙肝病毒，但是代价是纤维化等等副作用，这是我们对HBV的理解。

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 13:28

西安狂人发表于 2011-9-26 10:46
如果 k因子真的影响人体的免疫。如果潜伏期 > 50年很多人都无视。前提是必须根治 hbv dna ...

HBV的DNA来自HBV的RNA，而HBV的RNA来自细胞核里面的HBV的cccDNA。K的杀伤就是HBV RNA和cccDNA，所以最终结果是HBV DNA，蛋白质，RNA都下降。
而普通药物，只是控制了RNA不去生产HBV DNA，它的量并不减少，只要停药，这些一直存在的RNA，又会大量生产HBV DNA。
所以，要控制HBV DNA，源头是HBV RNA，而HBV RNA的源头是躲在细胞核里面的少量HBV cccDNA。
k正是杀死cccDNA和RNA的，所以对清除乙肝病毒有效。
你们可以了解一下，为什么干扰素和细胞因子，可以减少HBV RNA，DNA和蛋白质，而药物只能减少HBV DNA，而不能减少HBV RNA和蛋白质。就是细胞因子，通过k来做对乙肝病毒的武器，而药物只是控制RNA不生成DNA

作者: StephenW 时间: 2011-9-26 13:32

本帖最后由 StephenW 于 2011-9-26 13:33 编辑

lifflefield 发表于 2011-9-26 08:41
RNAi技术从1996年被发现开始就被赋予有可能治疗各种疾病。包括一些研究室用RNAi技术证明了，可以拟制艾 ...

"而蛋白质K最大的特点，就是多层次的杀伤HBV，" -

K因子的问题:
1.蛋白质K是什么？，它尚不存在，它只是一个在你脑海中的概念.
2.一旦你定义了您的K蛋白的氨基酸(amino acids sequence)，你要证明
K蛋白是安全的.
3.然后，你必须设计一个K -蛋白质的基因(gene)，该基因产生K蛋白.
4. 然后你必须导你的基因入人体的细胞，而不引起癌症，基因治疗最大的问题之

"而且大量的RNA存在于细胞中，会严重影响细胞工作" - 我不同意。我相信有许多酶(enzymes)在细胞内，未使用的RNA和其他复杂的分子将这些酶降解(degraded)。
RNA稳定性?

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 13:37

本帖最后由 lifflefield 于 2011-9-26 13:38 编辑

南来飞鸿发表于 2011-9-26 12:10
请楼主说明一下，如果顺利，你的这套方法，最快什么时候用于人体？你想我们怎么做？集体请求政府立项吗？ ...

用于人体，当然需要很长的论证。而且我本人并不是主攻HBV方向的，在国外，研究HBV得不到太大的资助，我本职工作，是HIV，艾滋病毒，我们做艾滋病毒比较方便，一在于资金很好申请，二在于，临床展开相对容易，大多数的HIV患者，都期待基因治疗，这也是唯一的途径，所以FDA能够很快的给你一些许可，让你们加速临床实验。
而HBV研究，想应用最新的基因治疗，第一点就是所谓，杀鸡要用牛刀的道理？基因治疗，多数都是所谓的大病，比如癌症和艾滋。 HBV有疫苗，有药物，能够很好的被控制，只是20.30年后，直接引起癌变。所以，在临床上实验，需要很多反正论证的时间，包括国内医院的太多，和患者的理解等等。
我是想来投石问路，想把所发现早些应用，只有国内有庞大的HBV临床样品了。我个人是近些年不太可能回国参与研究，只能依靠国内医院搞临床合作，我这里还要负责HIV的基因治疗工作。我目前只是提前看一下，临床上基因治疗在国内应用于HBV的可能性而已？

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 13:52

StephenW 发表于 2011-9-26 13:32
"而蛋白质K最大的特点，就是多层次的杀伤HBV，" -

K因子的问题:

K因子的问题:
1.蛋白质K是什么？，它尚不存在，它只是一个在你脑海中的概念.
2.一旦你定义了您的K蛋白的氨基酸(amino acids sequence)，你要证明
K蛋白是安全的.
3.然后，你必须设计一个K -蛋白质的基因(gene)，该基因产生K蛋白.
4. 然后你必须导你的基因入人体的细胞，而不引起癌症，基因治疗最大的问题之

"而且大量的RNA存在于细胞中，会严重影响细胞工作" - 我不同意。我相信有许多酶(enzymes)在细胞内，未使用的RNA和其他复杂的分子将这些酶降解(degraded)。
RNA稳定性?
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－1.我们只能说的更细了，k因子我目前还不能直接表述，它是蛋白质没错，它的原理我已经讲明了，就是识别HBV polymerase 和pregenome RNA的结合，而将自己binding的各种RNase带到HBV RNA上，引起前体RNA降解。这类酶包括RNA Exosome和Xrn1，还有UPF1等下游事件。（这些我个人都在今年国际病毒学会发表过）
2.在K蛋白引入一个氨基酸突变，就让它的酶活性丧失，但是它的结构完整，依然能够把RNA酶类带到HBV RNA上，同时K还能够阻止HBV RNA翻译。
3.基因不需要设计，直接clone到病毒载体上就可以了。k的优点就是200氨基酸，完全在rAAV病毒最佳允许范围内。
4。癌症，这是我们一直所面对的问题，天然的有活性的k因子，如果不加调控，必然引起各个组织的癌变，这点在老鼠上表露无疑，这也是为什么干扰素后期不管如何再用，k都不会继续存在的道理，而且国际上有很多论证，k因为才是引起肝癌的因子，正是可能因为 HBV感染激活了，细胞因子，后增加了k因子的表达，k一面杀死了乙肝，但是另一面它的活性长期存在就造成肝癌。所以，我们必须改造k因子。
5，我说过了，改造过的k因子对细胞没有危害，至今老鼠上没有看到任何表形的变化。而且，我们同时用四环素控制了k因子的存在，只有服用四环素，改造后的k才能存在于肝脏。
一句话：我们就是改造了，干扰素激活的一个下游分子，去杀死和清除乙肝病毒，也就是我们找到了干扰素的子弹，想扩大它的正效果，避免副效果。

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 13:59

StephenW 发表于 2011-9-26 13:32
"而蛋白质K最大的特点，就是多层次的杀伤HBV，" -

K因子的问题:

而且大量的RNA存在于细胞中，会严重影响细胞工作" - 我不同意。我相信有许多酶(enzymes)在细胞内，未使用的RNA和其他复杂的分子将这些酶降解(degraded)。
RNA稳定性？－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
你可能不知道siRNA，也就是寡聚RNA的危害。就是细胞实验，过多的寡聚RNA都能引起细胞凋亡，而且RNA并不稳定。你我表达的意思在于：
你知否指的的是，在体外合成寡聚RNA，然后转入人体？还是，用rAAV病毒携带RNA进入呢？
后者的话，因为这种RNA生产，需要U6启动子，所以产生效果往往不如前者，但是前者虽然效果好，又不能高效导入体内。
RNA的不稳定性，是指它容易干扰细胞其他RNA，虽然RNA要求配对，但是在实际过程中，很多不是target的RNA还是被降解，这也就是为什么RNAi有时候不靠谱，要反复论证它知否真的专一降解某个RNA。
我不排斥RNAi对于基因治疗，但是RNAi至今很难找到很成功的案例罢了，我指的是病人，而在HBV上 RNAi没有K因子的powerful能力，所以我忽略了RNAi的基因治疗。

作者: StephenW 时间: 2011-9-26 14:03

lifflefield 发表于 2011-9-26 13:22
我所说的，应该是我表示学术上最大的通俗性，所以势必有学术上的误差，因为这不是学术文章。改造过的rAAV ...

AAV genome, transcriptome and proteomeThe AAV genome is built of single-stranded deoxyribonucleic acid (ssDNA), either positive- or negative-sensed, which is about 4.7 kilobase long. The genome comprises inverted terminal repeats (ITRs) at both ends of the DNA strand, and two open reading frames (ORFs): rep and cap. The former is composed of four overlapping genes encoding Rep proteins required for the AAV life cycle, and the latter contains overlapping nucleotide sequences of capsid proteins: VP1, VP2 and VP3, which interact together to form a capsid of an icosahedral symmetry.[11]
[edit] ITR sequencesThe Inverted Terminal Repeat (ITR) sequences comprise 145 bases each. They were named so because of their symmetry, which was shown to be required for efficient multiplication of the AAV genome.[12] Another property of these sequences is their ability to form a hairpin, which contributes to so-called self-priming that allows primase-independent synthesis of the second DNA strand. The ITRs were also shown to be required for both integration of the AAV DNA into the host cell genome (19th chromosome in humans) and rescue from it,[13][14] as well as for efficient encapsidation of the AAV DNA combined with generation of a fully assembled, deoxyribonuclease-resistant AAV particles.[15]
With regard to gene therapy, ITRs seem to be the only sequences required in cis next to the therapeutic gene: structural (cap) and packaging (rep) genes can be delivered in trans. With this assumption many methods were established for efficient production of recombinant AAV (rAAV) vectors containing a reporter or therapeutic gene. However, it was also published that the ITRs are not the only elements required in cis for the effective replication and encapsidation. A few research groups have identified a sequence designated cis-acting Rep-dependent element (CARE) inside the coding sequence of the rep gene. CARE was shown to augment the replication and encapsidation when present in cis.[16][17][18][19]

"释放k因子，只有一次侵染。这个基因改造病毒，是在体外培养好的，并不需要人体培养，当培养好的改造过的rAAV病毒，进入肝脏，只做一次侵染，同时我们构建四环素调控抗生素，只有注射四环素，rAAV病毒才开始生成k因子，一旦病人体内乙肝病毒被清除干净后，停止服用四环素，rAAV病毒就会停止生产K因子。"
"只有一次侵染" - 这可能吗？
"释放k因子" - 这可能吗？
"四环素调控抗生素" (Regulation of Gene Expression by Tetracycline) -也很难.

"你所查到的是天然rAAV病毒。" - rAAV recombinant AAV is a type of recombinant DNA:

重組DNA是一种人工合成的脱氧核糖核酸。它是把一般不同时出现的DNA序列组合到一起而产生的[1]。从遺傳工程的观点来看重組DNA是把相关的DNA添加到已有生物的基因組中，比如细菌的质粒中，其目的是为了改变或者添加特别是的特性，比如免疫[1]。重組DNA与遺傳重組不是一回事。它不是重组细胞内或者染色体上已经存在的基因组，而完全是通过外部工程达到的[1]。重组蛋白质是从重組DNA合成出来的蛋白质[2]。
重組DNA技术是1973年由斯坦利·诺曼·科恩和赫伯特·玻意尔设计的。1974年他们发表了他们的设计[3]。在这篇论文中他们描述了分离和放大基因或者DNA片断，然后精确地把它们插入其它细胞中，由此制造出转基因细菌。沃納·亞伯、丹尼爾·那森斯和漢彌爾頓·史密斯发明了限制酶才使得重組DNA技术可行，为此他们获得了1978年诺贝尔医学奖。

作者: 走遍四方 时间: 2011-9-26 14:13

回复 lifflefield 的帖子

这个药物会不会包含你所指的这个蛋白质呢？

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 14:14

本帖最后由 lifflefield 于 2011-9-26 14:17 编辑

StephenW 发表于 2011-9-26 14:03
AAV genome, transcriptome and proteomeThe AAV genome is built of single-stranded deoxyribonucleic ...

"只有一次侵染" - 这可能吗？
"释放k因子" - 这可能吗？
"四环素调控抗生素" (Regulation of Gene Expression by Tetracycline) -也很难.--------------------------------------------
只有一次侵染，对的。
释放k，这是没有问题的。
四环素调控，这是最基本的tet on系统，非常简单，学过生物学的都会知道的。
我聚四环素只是一个例子，它很基本，大家都知道，其实我们未必用这么原始的调控方式了。
四环素调控转录起始分 Tet on和off两个系统，我们可以用on，这个系统，也就是存在四环素，转录才发生，k才会存在

rAAV病毒和其他病毒用法，你可以参考正经网站，不要wiki了。
www.genetherapynet.com/what-is-gene-therapy.html

作者: StephenW 时间: 2011-9-26 14:17

回复 lifflefield 的帖子

"我不排斥RNAi对于基因治疗，但是RNAi至今很难找到很成功的案例罢了，我指的是病人，而在HBV上 RNAi没有K因子的powerful能力，所以我忽略了RNAi的基因治疗。" - same conclusion applies to Gene therapy. It is very hard to understand your method without knowing what K因子 is. You have assumed that your k-protein has all the desirable properties that you wish for, together with good k-gene delivery and regulation systems, but is it feasible in a reasonable time frame?

Interferon is part of our innate immune system, it directly suppresses viral replication inside an infected cells, it also signals our adaptive immune system, to kill infected infected cells, thereby clearing the viral infection, at a cost.

Looking forward to hearing more about your k-factor.

作者: 走遍四方 时间: 2011-9-26 14:19

感谢楼主专业最前沿的的知识。

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 14:21

走遍四方发表于 2011-9-26 14:13
回复 lifflefield 的帖子

这个药物会不会包含你所指的这个蛋白质呢？

完全不同，我所说的是，干扰素的效应分子，而非这类lamine多肽。当然，如果混合用，说不定疗效更好

作者: 走遍四方 时间: 2011-9-26 14:24

本帖最后由走遍四方于 2011-9-26 14:54 编辑

回复 lifflefield 的帖子

谢谢确认。我们都是外行呀

作者: StephenW 时间: 2011-9-26 14:25

回复 lifflefield 的帖子

只有一次侵染，对的。 - how?
释放k，这是没有问题的。- You meaning cleaving your k-gene from your rAAV or something else?
四环素调控，这是最基本的tet on系统，非常简单，学过生物学的都会知道的。
我聚四环素只是一个例子，它很基本，大家都知道，其实我们未必用这么原始的调控方式了。
四环素调控转录起始分 Tet on和off两个系统，我们可以用on，这个系统，也就是存在四环素，转录才发生，k才会存在 - Does it work as perfect as you describe in vivo? Sorry, I am only a layman, so you have to be patient with my questions.

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 14:27

StephenW 发表于 2011-9-26 14:17
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"我不排斥RNAi对于基因治疗，但是RNAi至今很难找到很成功的案例罢了，我指的是 ...

Interferon is part of our innate immune system, it directly suppresses viral replication inside an infected cells, it also signals our adaptive immune system, to kill infected infected cells, thereby clearing the viral infection, at a cost.
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
没错，你所说的是细胞因子引起的adapative immunity，而我所说的是innate immunity，想比你应该知道细胞内有组织病毒复制的因子吧，包括识别和降解它们DNA或者RNA的分子，我们所做的就是innate，而非adaptive。不是通过细胞免疫或者抗体免疫杀伤干扰细胞，而是通过细胞自己内部的因子组织病毒生产。我建议你去看看 APOBEC3G和HIV如何在innate作用的。

Looking forward to hearing more about your k-factor.
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
ok的，等我一段时间，我愿意跟你继续探讨k－factor，怎么识别病毒RNA分子和cccDNA的，这是一个也许全新的host defend system。

作者: StephenW 时间: 2011-9-26 14:36

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APOBEC3G（A3G）是一种阻止HIV复制的蛋白质。这种蛋白质在人类抗病毒的先天免疫中扮演着重要角色。 APOBEC3G作为一种脱氨酶，可以诱导HIV的DNA上的胞嘧啶替换为尿嘧啶，这就导致完整的前病毒数量减少。慢病毒进化出了一种叫做Vif的基因来消除这种影响，但鼠及大多数灵长类的A3G却不能被HIV的Vif识别，这是导致HIV不感染其他动物的一个主要原因。人的APOBEC3G是一种强有力的逆转录病毒抑制剂。A3G是哺乳动物特有的，但它在不同物种间的差异却很大。
[编辑] 结构APOBEC3G的作用原理是在单链DNA复制的过程中使胞嘧啶脱去氨基变成尿嘧啶，它的基因位于第22号染色体。 A3G含有两个典型的胞嘧啶脱氨酶区，其中的C-端已被确认起着调解胞嘧啶脱氨基的作用。这两个区都分别含有一个催化区，它们是CD1区和CD2区。利用四聚体APOBEC2（A2）蛋白的晶体，可以推断A3G上的残基存在着电势来调解蛋白质的齐聚反应。在胞嘧啶脱氨酶区不活跃的N-端上，由酪氨酸-124和色氨酸-127调解着A3G的齐聚反应，这使得它可以被包装进HIV-1的病毒颗粒中。 A3G在A2模板结构上的同源建模说明它通过二聚体界面形成了一个正电荷堆积的区域。这个正电荷区域促进了A3G的齐聚反应和提高了它的抗病毒能力。

"ok的，等我一段时间，我愿意跟你继续探讨k－factor，怎么识别病毒RNA分子和cccDNA的，这是一个也许全新的host defend system。" - thanks

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 14:42

StephenW 发表于 2011-9-26 14:25
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只有一次侵染，对的。 - how?

1.请google tet on and tet off 很多回答的。2.只有一次侵染，对的。 - how?
－－－－－－－－－－－－－－－－－－
因为改造过的rAAV并非真病毒，rAAV需要完整病毒蛋白而继续复制自己，我们破坏了它的蛋白质，只让它表达我们要的因子，
它就像一个载体，可以发挥第一次的侵染，之后，它不断生产k因子，被我们所利用和剥削。所以，没有病毒周期，只有一次侵染。

3.释放k，这是没有问题的。- You meaning cleaving your k-gene from your rAAV or something else?
－－－－－－－－－
我所说的释放，其实应该是指rAAV病毒，误认为k是自己的基因，开始转录并翻译成K因子，请明白k是细胞内自己翻译的，我们转进去的是携带改造过的k基因的rAAV病毒，就像乙肝病毒利用细胞不断生产自己的蛋白一样，rAAV也是利用细胞生产我们要的k，而k就能去识别乙肝病毒，而不需要干扰素给予信号。

4.Does it work as perfect as you describe in vivo
－－－－－－－－－－－－－－－－
你指的是四环素激活？？我只是比喻这个调控，如果要在vivo，就是体内做的话，不能用四环素，要构建更加的诱导系统，
比如给老鼠喂食，激活转进去的基因，是非常常用的方法。四环素如果构建进入人体，副作用应该很大，不应该尝试，而应该寻找更好的激活系统，这都是以后需要工作流程。

作者: lifflefield 时间: 2011-9-26 14:51

StephenW 发表于 2011-9-26 14:36
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APOBEC3G（A3G）是一种阻止HIV复制的蛋白质。这种蛋白质在人类抗病毒的先天免疫 ...

APOBEC3G同样超级强力的组织HBV复制，效果等于现在市面上的药物。我们每个人肝脏细胞内，都有定量的APOBEC3G，而且它也会上调在干扰素的刺激下。
但是，APOBEC3G，不能减少HBV cccDNA和RNA，这两点只有K因子能够做到。
你也许会问为什么不用rAAV带入A3G呢，因为药物已经达到了它的效果，而且A3G太大，500氨基酸左右，rAAV不太适合携带。

作者: StephenW 时间: 2011-9-26 15:59

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"不能减少HBV cccDNA和RNA，这两点只有K因子能够做到。
你也许会问为什么不用rAAV带入A3G呢，因为药物已经达到了它的效果，而且A3G太大，500氨基酸左右，rAAV不太适合携带。"

Surely, once you can "destroy" cccDNA, there is no need to reduce RNA, no cccDNA, no RNA. rAAV, recombinant AAV, can come in many shapes and forms. Of course, we look forward to hearing how your k-factor will "destroy" the cccDNA inside the nucleus.

作者: StephenW 时间: 2011-9-26 16:14

lifflefield 发表于 2011-9-26 14:42
1.请google tet on and tet off 很多回答的。2.只有一次侵染，对的。 - how?
－－－－－－－－－－－－ ...

2. You are saying that you can engineer the AAV virus not to replicate (no expression of its viral genes, therefor no viral proteins to re-constitute a new AAV virus?), yet it will only allow the expression of the K-gene to produce your k-protein? If your rAAV cannot replicate, how will you produce the massive amount of rAAV for injection into the human body?
3.You mean expression of the k-gene to produce k-protein, no problem. This is what Gene therapy is all about.
4. What other gene expression regulation systems are you talking about?

Finally, I know this is pedantic, what about hbv mutants that can escape your engineered "immune control" (unless it is so powerful that it can knock out all the cccDNA)?

作者: 走遍四方 时间: 2011-9-26 16:27

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Finally, I know this is pedantic, what about hbv mutants that can escape your engineered "immune control" (unless it is so powerful that it can knock out all the cccDNA)?
--------------k 因子可能target 的是各个hbv 中共有的东西，mutant的hbv也只是hbv中某些点位

作者: StephenW 时间: 2011-9-26 16:39

走遍四方发表于 2011-9-26 16:27
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Finally, I know this is pedantic, what about hbv mutants that can escape your ...

I know I am just being difficult, but I guess k-factor is based on APBEC3G, and HIV has evolved a defence mechanism against it. Likewise, many viruses have evolved mechanism to reduce the antiviral effects of Interferon.

APOBEC3G (apoplipoprotein B mRNA-editing, enzyme-catalytic, polypeptide-like 3G) is a human enzyme encoded by the APOBEC3G gene that belongs to the APOBEC superfamily of proteins.[1] This family of proteins has been suggested to play an important role in innate anti-viral immunity.[2] APOBEC3G is a cytadine deaminase enzyme and is therefore known as DNA dC->dU-editing enzyme APOBEC-3G and APOBEC-related cytidine deaminase (ARCD).[1]
APOBEC3G exerts innate antiretroviral immune activity against retroviruses, most notably HIV, by interfering with proper replication. However, lentiviruses such as HIV have evolved the Viral infectivity factor (Vif) protein in order to counteract this effect. Vif interacts with APOBEC3G and triggers the ubiquitination and degradation of APOBEC3G via the proteasomal pathway.[3]

作者: 走遍四方 时间: 2011-9-26 16:56

本帖最后由走遍四方于 2011-9-26 16:59 编辑

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Not difficult, very precise,.
不难处，很严谨，
All you concerns must be cleared when Go-live to practice.

作者: 蔡小楠 时间: 2011-9-26 19:37

好像是中国人的东西哦！！！可靠吗？

作者: yh0046 时间: 2011-9-26 20:56

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楼主，我非常支持你的研究，我是个生物学教师，我愿意接受基因治疗！只希望它能早日成功，早日让广大患者脱离苦海！

作者: yh0046 时间: 2011-9-26 20:59

我能接收基因治疗，我是中学教师，也可起到宣传作用，希望该技术早日成功！

作者: cshbv 时间: 2011-9-26 21:00

本帖最后由 cshbv 于 2011-9-26 21:00 编辑

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如果基因治疗能够彻底根除乙肝，大家能够接受多少？-- 你的题目是什么意思？能够接受多少钱吗？还是接受多少k因子注射量？
相信如果你们的技术可行的话，找合作伙伴，或者找临床实验对象，是不成问题的。
国内有家RNAi的顶尖公司Biomics也在研究HBV的RNAi方案。请问你对他们的方法有所了解吗？或者有所比较？如果能比他们强，那估计申请国家基金项目，或者跟国内的机构联合申请都应该是没问题的。
另外国内有困难的话，可以去别的国家，世界上不是只有中国有乙肝的问题。相信很多国家会比中国更加透明和注重知识产权保护。

作者: brucexm 时间: 2011-9-26 23:13

本帖最后由 brucexm 于 2011-9-26 23:17 编辑

to ifflefield，对于大家能够接受多少这问题，个人觉得，如果您提供的方法要适用临床，首先还是考量与医院单位的合作，然后基于医院单位的信用，国内患者应该会有一个比较好的接受心理预期。

附上一张HBV复制机理图解，应该能有助于各位对ifflefield某些说明的理解。

HBV复制图

ifflefield提供一个很好的应用方向，大家努力提问题

作者: foto2002 时间: 2011-9-27 00:58

The U.S. government and FDA are selfish . The U.S. government declared they want to save the humanright, but they neglecting 130 million Chinese people‘s suffering . Don’t forget us! We also are the human. We like the blue sky, we also want to play in the sunshine , we love our life.Why you to authorized the K-gene for the HIV ?Why not go with the HBV?Don‘t criticized our country is no humanright. I hate the hypocritical guys!

作者: hchu 时间: 2011-9-27 01:04

如果基因治疗能够彻底根除乙肝，大家能够接受多少？
我如果你是问这里的人的话，我相信是能接受100%！你可以马上进行你这一伟大工程了。建议你与国内的一些大机构合作。这边一直在搞的二只治疗性疫苗，都是在与机构合作的……

作者: 非东亚病夫 时间: 2011-9-27 08:40

说得很大口气，做事有心无力~~！
中国为什么没有人才，有版可依

作者: lifflefield 时间: 2011-9-27 13:37

本帖最后由 lifflefield 于 2011-9-27 13:55 编辑

StephenW 发表于 2011-9-26 16:14
2. You are saying that you can engineer the AAV virus not to replicate (no expression of its viral ...

1.rAAV感染只有一次，所以感染效率非常关键，如果不高的话，只能寻找其他途径，还可以反复感染，就是不断的注射。 2. 至于如何清除HBV的cccDNA，我提供一篇nature子刊的文献

APOBEC3 proteins mediate the clearance of foreign DNA from human cells 可以google。这个理论就是，APOBEC家族让在细胞核的HBV cccDNA上的dC变成dU，因为脱氨作用，而恰恰dU是不被允许
存在在DNA上，所以UNG，这类酶就会剔除在DNA上的dU，致使这个位点是没有碱基的，然后细胞核内的APE酶，不允许空位点DNA的存在，就降解了HBV cccDNA。 HBV cccDNA在细胞核内最多也就10-50，被这个家族作用后，cccDNA被显著降解。这也是实验结果之一。这也就是细胞抗外源DNA的一种机制，可惜的是这种因子需要激活。

作者: lifflefield 时间: 2011-9-27 13:46

cshbv 发表于 2011-9-26 21:00
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如果基因治疗能够彻底根除乙肝，大家能够接受多少？-- 你的题目是什么意思？能够 ...

我的问题是：基因治疗能否被国内接受。因为基因治疗算是前沿的治疗方式，大多数是应用于癌症方面。对于乙肝，既有疫苗又有药物，在大量投入基因治疗，即使如果能够清除乙肝病毒，这种投入在国内是否有必要？目前跟钱一点关系都没有。我的最终目的：是在国内让其他人做临床，而不是我个人回国做临床。因为我的主攻方向，还是偏重艾滋病和丙型肝炎。国内最大的优势就是临床优势，这是我希望推广疗法以及拿到最可靠样品数据的地方。我希望，基因治疗既能有艾滋病有疗效，也能对乙肝有疗效。
对以乙肝，我们选择很多：比如先基因治疗，到达一定程度在进行药物治疗，最终希望清除乙肝病毒。我只是把我的设想说了一下，离临床还很早很早，这个状态，取决于国内一些大医院的工作量和研究量。毕竟，我们是合作，而我个人很难介入临床研究太多的。我起的作用，是从机理上论述，提供老鼠模型，以及最基本的rAAV病毒的构建。其他的都要依靠，国内的大型医院，对医院的选择也是有些问题。

作者: lifflefield 时间: 2011-9-27 13:48

brucexm 发表于 2011-9-26 23:13
to ifflefield，对于大家能够接受多少这问题，个人觉得，如果您提供的方法要适用临床，首先还是考量与医院 ...

非常感谢，不过你的图标太复杂，我来提供更简单的图，来说明我的机理吧。

作者: lifflefield 时间: 2011-9-27 13:54

hchu 发表于 2011-9-27 01:04
如果基因治疗能够彻底根除乙肝，大家能够接受多少？
我如果你是问这里的人的话，我相信是能接受100%！你可 ...

绝对不是什么伟大工程，只是我个人兴趣，我只是希望我的发现能够被应用，享受满足感。我以前对HBV是一点兴趣都没有的，我对HIV最有兴趣，但是APOBEC这个家族对抗HIV也对抗HBV，致使我开始适用相对简单和好操作的HBV，
才在HBV有研究，我的最终目的，是拿HBV的机理，进一步研究HIV，我的基金也是来自于HIV，而非HBV，也是是说，HBV是副业。即使我有HBV的结果，
没有HIV的结果的话，3年后，资金的延续性就会出现问题。所以我必须对HIV负责。 HBV在国外很难拿到大笔的资助，包括个人捐款。我当然希望跟国内大的临床医院合作了，还要慢慢可靠进行。

作者: lifflefield 时间: 2011-9-27 13:58

lifflefield 发表于 2011-9-27 13:48
非常感谢，不过你的图标太复杂，我来提供更简单的图，来说明我的机理吧。 ...

K对HBV杀伤就是两个红箭头的那里的降解

作者: StephenW 时间: 2011-9-27 14:23

本帖最后由 StephenW 于 2011-9-27 14:25 编辑

lifflefield 发表于 2011-9-27 13:37
1.rAAV感染只有一次，所以感染效率非常关键，如果不高的话，只能寻找其他途径，还可以反复感染，就是不断 ...

Many thanks for the reference, look like it is an interesting paper (from the abstract).

APOBEC3 proteins mediate the clearance of foreign DNA from human cells

Nature Structural & Molecular Biology 17, 222–229 (2010) doi:10.1038/nsmb.1744 Received 13 September 2009 Accepted 09 November 2009 Published online 10 January 2010
Abstract
Bacteria evolved restriction endonucleases to prevent interspecies DNA transmission and bacteriophage infection. Here we show that human cells possess an analogous mechanism. APOBEC3A is induced by interferon following DNA detection, and it deaminates foreign double-stranded DNA cytidines to uridines. These atypical DNA nucleosides are converted by the uracil DNA glycosylase UNG2 to abasic lesions, which lead to foreign DNA degradation. This mechanism is evident in cell lines and primary monocytes, where up to 97% of cytidines in foreign DNA are deaminated. In contrast, cellular genomic DNA appears unaffected. Several other APOBEC3s also restrict foreign gene transfer. Related proteins exist in all vertebrates, indicating that foreign DNA restriction may be a conserved innate immune defense mechanism. The efficiency and fidelity of genetic engineering, gene therapy, and DNA vaccination are likely to be influenced by this anti-DNA defense system.

作者: 梦人 时间: 2011-9-27 18:45

我非常支持你的研究，我愿意接受基因治疗！只希望它能早日成功，早日让广大患者脱离苦海！

作者: 0914 时间: 2011-9-27 21:13

楼主》只有没有了乙肝，我们才能真正的自由。自由！freedom！你懂的！

作者: 0914 时间: 2011-9-27 21:21

楼主你招不招研究生啊。我能不能跟着你搞这方面的东西。我是本科生，临床的，已经毕业在医院上班....

作者: mingbai 时间: 2011-9-27 21:54

唉，如果乙肝是美国的国病，恐怕一早就有特效药了。现在看来人家已经掌握了消灭乙肝病毒的方法了，但是外国乙肝少啊，所以人家不想研究。依靠国内的技术，恐怕我们等到死那天还没研究出来。

作者: 走遍四方 时间: 2011-9-28 09:37

本帖最后由走遍四方于 2011-9-28 09:45 编辑

估计又只能期待他们好法出来对付HCV，然后再对法HBV，像干扰素一样，，依论坛当今的影响力，应该尝试更高效有组织起来加速这一个过程，大家都知道，华人在美国的前沿研究圈内高手众多，他们很多就像楼主一样很愿意加速这一过程吧。。。历史需要英雄出世去加速变化。。。

作者: StephenW 时间: 2011-9-28 12:24

走遍四方发表于 2011-9-28 09:37
估计又只能期待他们好法出来对付HCV，然后再对法HBV，像干扰素一样，，依论坛当今的影响力，应该尝试更高 ...

"华人在美国的前沿研究圈内高手众多" - 非常同意, 不仅在美国，但在世界各地和中国境内.

作者: 走遍四方 时间: 2011-9-28 13:02

StephenW 发表于 2011-9-28 12:24
"华人在美国的前沿研究圈内高手众多" - 非常同意, 不仅在美国，但在世界各地和中国境内.
...

Chairman Mao‘s 杰作

作者: kaorusai 时间: 2011-9-28 13:02

我们需要奇迹...

作者: 20140 时间: 2011-9-28 14:04

以前也是常常会想到用一个东西将能杀死hbv的东西带到肝细胞内将hbv全部弄死~呵呵今天看到了人家都在研究了~感觉希望很大~就是不知道什么时候能用到临床~想想应该还需要很长的过程吧毕竟那是一个很复杂的过程~不过我相信随着hiv研究的进展~hbv会从中获益的~不过可悲的是我们乙人可恨的是政府~为什么数量这么庞大的国病不能多点投入多点研究呢？

作者: 9病成医 时间: 2011-9-28 21:58

LZ是在调查患者对这种治疗方式的接受程度。
我以为，一，取决于这种治疗方式的实际效果，即根治的程度和带来的副作用的程度；二，治疗成本，只要效果好，肯定有人用，这是肯定的，但成本太高，会有一定比例的人用不起。

作者: lifevendor 时间: 2011-9-29 09:12

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“只是控制了RNA不去生产HBV DNA，它的量并不减少，只要停药，这些一直存在的RNA，又会大量生产HBV DNA。
所以，要控制HBV DNA，源头是HBV RNA，而HBV RNA的源头是躲在细胞核里面的少量HBV cccDNA。”
我对这个观点不赞成：
1。假设核苷类药物没有控制RNA，RNA的半衰期也是很短的，所以肝细胞内，一直存在的RNA量取决于cccDNA的转译率，RNA也不是一直累积下来的，RNA会被分解掉。
2. 事实上核苷类药物的作用点是破坏从RNA逆转录到DNA的过程，这个时候RNA已经包裹在病毒的hbcAg核内了，聚合酶通过使用核苷类药物取代天然的A,C,G,T对DNA的合成，或者是核苷类药物干预了聚合酶的正常功能，导致病毒DNA的继续合成造成困难（病毒变异的动力在这里），大部分RNA要么已经包裹，并且降和病毒颗粒释放到细胞外，即使核苷类药物抑制病毒的聚合酶，但是没有干扰病毒聚合酶后面的RNAase，所以RNA可能终究会被聚合酶中的RNAase降解调？。

是否有论文证实服用核苷类药物，导致肝细胞内病毒RNA的累积、？

作者: lifflefield 时间: 2011-9-29 10:21

给各位一个不幸的消息：gene therapy治疗乙肝还是非常困难的，老专家还是建议终身吃药。甚至，都不建议研究。我顺便转一篇关于siRNA，可能用于治疗乙肝的文章，那是03年的文章，至今的stanford组已经估计放弃了。其实原因，就是乙肝有很多的药物和干扰素控制，genethearpy还是集中在癌症和艾滋病上比较靠谱。国际上研究基因治疗HBV的也不多。 03年的RNAi治疗乙肝，也是因为RNAi能够引起HBV RNA降解。 Inhibition of hepatitis B virus in mice by RNA interference
nature.com/nbt/journal/v21/n6/full/nbt824.html

作者: lifflefield 时间: 2011-9-29 10:22

0914 发表于 2011-9-27 21:21
楼主你招不招研究生啊。我能不能跟着你搞这方面的东西。我是本科生，临床的，已经毕业在医院上班.... ...

你要申请奖学金。如果你是HBV携带者，是不能做HBV研究工作的。

作者: lifflefield 时间: 2011-9-29 10:34

lifevendor 发表于 2011-9-29 09:12
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“只是控制了RNA不去生产HBV DNA，它的量并不减少，只要停药，这些一直存在的RNA ...

1。
假设核苷类药物没有控制RNA，RNA的半衰期也是很短的，---------------------------------------------------------------------------
细胞内源RNA跟病毒RNA的半衰期可能有很大差别。不要小看病毒RNA躲避衰亡的能力。
如果，按你所说的，RNA都衰减了，为何，停药之后，HBV会大量反弹，超过正常时期病毒量。这个不能归于cccDNA的转录增强吧？只能是cccDNA不断产生RNA，衰亡RNA和新产生RNA共同形成了一个动态的RNA累计。

2.事实上核苷类药物的作用点是破坏从RNA逆转录到DNA的过程，这个时候RNA已经包裹在病毒的hbcAg核内了
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
大量的病毒RNA没有被包裹进入病毒颗粒，被包裹进入的是少量RNA。没错，在RNA被衣壳蛋白包裹之后，才能开始在反聚合酶的作用下生成DNA，这里是药物的作用的位点。你所说的是一知半解的聚合酶的RNaseH的功能？？ RNA生成DNA第一条链，之后在衣壳里被降解，是为了方便第二条DNA链生成。

3.乙肝病毒RNA存在于细胞是RNA降解和cccDNA生成的RNA不断累计的动态平衡。乙肝病毒只有四条RNA分子，其中最难的是 pregenome RNA这个，3.5kb的分子，它在5-端有严格配对的颈环结构，它与一般RNA代谢不同。

作者: lifflefield 时间: 2011-9-29 10:36

20140 发表于 2011-9-28 14:04
以前也是常常会想到用一个东西将能杀死hbv的东西带到肝细胞内将hbv全部弄死~呵呵今天看到了人家都在研究了~ ...

国际投入乙肝研究，其实很大了。只是病毒病，本来就难根除，而控制病毒病，已经攻克了。现在乙肝这么多的药物，虽然不能清除乙肝病毒，但是生活下去没有问题。只要理疗合理，乙肝病患活到70岁以上是常见的

作者: 走遍四方 时间: 2011-9-29 10:40

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还是那句老话：美国/西方主流 HBV不多&大公司控制研究方向从而控制利润。。。。

作者: lifflefield 时间: 2011-9-29 10:40

走遍四方发表于 2011-9-28 09:37
估计又只能期待他们好法出来对付HCV，然后再对法HBV，像干扰素一样，，依论坛当今的影响力，应该尝试更高 ...

HCV 跟 HBV完全不同，彻底不同。 HCV是纯RNA病毒，不进入细胞核，而HBV是DNA病毒，进入细胞核。HCV更猛烈些，它能够侵染B细胞，容易导致淋巴癌，至今没有任何特效药。因为它用自己的RNA复制酶复制自己子代RNA
目前HCV最新的研究的，受体已经找到了，可以设计药物，防止HCV继续侵染。
而。HBV的肝脏侵染受体一直也没有人找到，也是因为不太重视的原因吧

作者: lifflefield 时间: 2011-9-29 10:42

走遍四方发表于 2011-9-29 10:40
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还是那句老话：美国/西方主流 HBV不多&大公司控制研究方向从而控制利润。。。。

所以，才要和国内合作啊。现在乙肝病毒的受体还没有找到呢？寻找乙肝病毒受体，不需要什么天才，只需要苦力找啊找就行了
千年，丙肝的受体刚被美国的组找到，现在就开始设计药物了，只要受体找到，如果用药物干扰病毒继续侵染细胞，那就最好的

作者: lifflefield 时间: 2011-9-29 10:48

本帖最后由 lifflefield 于 2011-9-29 10:55 编辑

跟我有所交际的医院或者专家，统统都会艾滋病的基因治疗有强大的兴趣和积极性，而对乙肝的基因治疗几乎都没有兴趣，大家都认为，乙肝有很多药物控制，不需要继续投入大量物力人力去彻底清除cccDNA，而且还不一定能够成功。所以，现在的状态，就是艾滋病，怎么做都可以，乙肝的话，只有设计药物这一条路，基因治疗，很不被看好啊。现在最实际对付乙肝的方法，就是药物。专家建议，终身吃药。现在乙肝病毒变异很快，但是药物也不断更新，同时在乙肝病毒各个生理活动阶段，都有会相应的抑制药物出现，同时，研究防止乙肝致癌变的药物和机理都在同时进行，比如服用一些抗癌变抑制剂一起。这样的话，乙肝会得到很大的控制，也是最实际的方法。

作者: 走遍四方 时间: 2011-9-29 10:52

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能够吸引刘德华孙正义呀这样的有钱人投资建立一个好的平台来研究就好就好了。他们不都是携带者。本论坛影响面还是相当广呀。。大家应该设法加速这个过程。。。也许老毛在世，一声令下，你所说的10年内必破吧

作者: lifflefield 时间: 2011-9-29 10:59

走遍四方发表于 2011-9-29 10:52
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能够吸引刘德华孙正义呀这样的有钱人投资建立一个好的平台来研究就好就好了。 ...

好的平台，应该这么做：（我很理解）不断的更新药物，配合乙肝病毒的变异，同时服用防止癌变的抑制剂，这些研究都要统统有效的进行。同时，我将把k因子的活性机理，加以论证，这样，就有设计药物的初步理念。虽然过程缓慢，但最终会有结果的。对于乙肝的基因治疗，只能先从动物中慢慢寻找最好的方案，先做一些机理研究，等待有最好的方法产生，再应用到临床。

作者: StephenW 时间: 2011-9-29 11:40

本帖最后由 StephenW 于 2011-9-29 11:43 编辑

lifflefield 发表于 2011-9-29 10:34
1。
假设核苷类药物没有控制RNA，RNA的半衰期也是很短的，------------------------------------------ ...

"停药之后，HBV会大量反弹，超过正常时期病毒量。这个不能归于cccDNA的转录增强吧？只能是cccDNA不断产生RNA，衰亡RNA和新产生RNA共同形成了一个动态的RNA累计。"

你可能是正确的，但我认为最可能的解释是, 不需要cccDNA的转录增强:
cccDNA转录生产新的病毒粒子和添加cccDNA的池（在同一细胞）。新的病毒粒子感染其他细胞.........事半功倍(multiplier)的效果.
另外HBV会大量反弹, 因为有大量有cccDNA感染的细胞.

作者: StephenW 时间: 2011-9-29 11:47

lifflefield 发表于 2011-9-29 10:22
你要申请奖学金。如果你是HBV携带者，是不能做HBV研究工作的。

"如果你是HBV携带者，是不能做HBV研究工作的。" - 如果这是真的，这将是最不科学的，纯粹的歧视.

作者: hchu 时间: 2011-9-29 12:37

请问楼主，你的“K”有可能很快形成有效药物吗？如有的话，请快马加马鞭。目前而言，国内的乙肝市场比丙肝、艾滋市场大得多，它的经济效益是个天文数字。建议面向国内发展吧！带上你的“K”和资料，来内地转一圈，作一轮学术交流报告，兴许有巨大的收获。

作者: lifflefield 时间: 2011-9-29 12:46

StephenW 发表于 2011-9-29 11:47
"如果你是HBV携带者，是不能做HBV研究工作的。" - 如果这是真的，这将是最不科学的，纯粹的歧视. ...

nono. 乙肝是个人隐私权其他人是无权知道的。除了我这个特例。因为从事乙肝病毒研究要定期注射疫苗如果不能注射疫苗会有一定风险性我是为了他的健康考虑

作者: StephenW 时间: 2011-9-29 12:51

本帖最后由 StephenW 于 2011-9-29 22:31 编辑

lifflefield 发表于 2011-9-29 10:34
1。
假设核苷类药物没有控制RNA，RNA的半衰期也是很短的，------------------------------------------ ...

"你所说的是一知半解的聚合酶的RNaseH的功能？？ RNA生成DNA第一条链，之后在衣壳里被降解，是为了方便第二条DNA链生成。"

This diagram may help:[This slide belongs to Professor P. Karayiannis, Imperial College, London]
[attach]240992[/attach]

作者: lifflefield 时间: 2011-9-29 12:53

hchu 发表于 2011-9-29 12:37
请问楼主，你的“K”有可能很快形成有效药物吗？如有的话，请快马加马鞭。目前而言，国内的乙肝市场比丙肝 ...

我的药物设计知识不多我目前认为不能。要设计的话。先要搞清楚作用基团以及空间结构图。这些目前不现实。再说药物很难进入细胞核接触到出cccDNA. 目前只有蛋白质导入才有疗效。开发药物需要更多的理论知识点我也要请教他人

作者: StephenW 时间: 2011-9-29 12:56

本帖最后由 StephenW 于 2011-9-29 12:56 编辑

lifflefield 发表于 2011-9-29 12:46
nono. 乙肝是个人隐私权其他人是无权知道的。除了我这个特例。因为从事乙肝病毒研究要定期注射疫苗如 ...

"如果不能注射疫苗会有一定风险性我是为了他的健康考虑" - 他已经有乙肝病毒，没有必要采取预防措施。我觉得很难理解为什么一个研究者需要定期注射疫苗?!

作者: StephenW 时间: 2011-9-29 13:08

本帖最后由 StephenW 于 2011-9-29 22:32 编辑

lifflefield 发表于 2011-9-29 10:40
HCV 跟 HBV完全不同，彻底不同。 HCV是纯RNA病毒，不进入细胞核，而HBV是DNA病毒，进入细胞核。HCV更猛烈 ...

"HBV的肝脏侵染受体一直也没有人找到，也是因为不太重视的原因吧" - 是的
[The following slide belongs to Professor P. Karayiannis, Imperial College, London]

[attach]241014[/attach]

But Mycrludex, Rep9AC, Squalamine - can interefere with entry/release.
但

Mycrludex，Rep9AC，Squalamine - 可以干扰进入/释放.

作者: lifevendor 时间: 2011-9-29 15:33

回复 lifflefield 的帖子

1。
假设核苷类药物没有控制RNA，RNA的半衰期也是很短的，---------------------------------------------------------------------------
细胞内源RNA跟病毒RNA的半衰期可能有很大差别。不要小看病毒RNA躲避衰亡的能力。
如果，按你所说的，RNA都衰减了，为何，停药之后，HBV会大量反弹，超过正常时期病毒量。这个不能归于cccDNA的转录增强吧？只能是cccDNA不断产生RNA，衰亡RNA和新产生RNA共同形成了一个动态的RNA累计。：病毒的复制是一个动态的过程，假设对病毒的数量是有免疫和药物相互协调作用下，停药后的过渡反弹，是因为病毒RNA的积累导致的，或者是由于药物将病毒下降到了一定程度，新的病毒平衡中，免疫作用效果的下降，这个时候停药，导致体内的平衡突然被破坏，而cccDNA的总量却维持不变，导致大量反弹？核苷类药物如果可以导致病毒RNA的累积，应该在实验上很好验证。

2.事实上核苷类药物的作用点是破坏从RNA逆转录到DNA的过程，这个时候RNA已经包裹在病毒的hbcAg核内了
－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－
大量的病毒RNA没有被包裹进入病毒颗粒，被包裹进入的是少量RNA。没错，在RNA被衣壳蛋白包裹之后，才能开始在反聚合酶的作用下生成DNA，这里是药物的作用的位点。你所说的是一知半解的聚合酶的RNaseH的功能？？ RNA生成DNA第一条链，之后在衣壳里被降解，是为了方便第二条DNA链生成。
我之所以有这个怀疑是Stephen提供过一篇论文，里面的病毒的电镜照片非常有意思
Secretion of Genome-Free Hepatitis B Virus – Single
Strand Blocking Model for Virion Morphogenesis of Pararetrovirus 这篇论文中的观察是，外排病毒颗粒大部分分为两种：空心的（没有DNA的）占据了90%，实心的（有双链DNA的），我的假设是只要和聚合酶包裹在一起的RNA如果没有被逆转录成DNA，也终究会被降解掉。我对RNaseH的具体的功能不是非常清楚，但是假设一段RNA紧密的挨着RNaseH，相互作用的几率就增加了很多，可能合成完第一条连之后，聚合酶转换到单链DNA上为模板，RNAseH和RNA的结合变得更容易？

3.乙肝病毒RNA存在于细胞是RNA降解和cccDNA生成的RNA不断累计的动态平衡。乙肝病毒只有四条RNA分子，其中最难的是 pregenome RNA这个，3.5kb的分子，它在5-端有严格配对的颈环结构，它与一般RNA代谢不同。

能否解释为什么不同？理论上pgRNA最长，最容易被破坏。pgRNA是否马上与聚合酶结合还是？

作者: yh0046 时间: 2011-9-30 18:56

给人希望，又让人失望。我总有种感觉，乙肝会被治愈，希望这一天早点到来，在有生之年！！

作者: 我和太阳 时间: 2011-9-30 20:28

希望奇迹能尽快出现啊

作者: 一定转阴 时间: 2011-9-30 22:48

期待中。。。。。。。。

作者: mingbai 时间: 2011-9-30 22:49

lifflefield 发表于 2011-9-29 10:40
HCV 跟 HBV完全不同，彻底不同。 HCV是纯RNA病毒，不进入细胞核，而HBV是DNA病毒，进入细胞核。HCV更猛烈 ...

不是说HCV已经有特效药，派罗欣加利巴韦林吗？80%能治愈

作者: kaorusai 时间: 2011-10-2 15:42

StephenW 发表于 2011-9-29 13:08
"HBV的肝脏侵染受体一直也没有人找到，也是因为不太重视的原因吧" - 是的
[The following slide belongs t ...

Squalamine就是鲨鱼的那个东西吧，不是说那东西如果达到能够杀死乙肝病毒的浓度的话，就会引起中毒吗！

作者: StephenW 时间: 2011-10-2 15:56

本帖最后由 StephenW 于 2011-10-2 15:57 编辑

kaorusai 发表于 2011-10-2 15:42
Squalamine就是鲨鱼的那个东西吧，不是说那东西如果达到能够杀死乙肝病毒的浓度的话，就会引起中毒吗！
...

正确的，似乎太多(高于或低于能够杀死乙肝病毒的浓度?)，可能会产生严重的副作用。

作者: lifflefield 时间: 2011-12-14 14:45

各位，我又回来了很久不见了。基因治疗乙肝，已经论证为不靠谱的想法，实效太难
还是通过理论设计药物比较实际。

作者: 春天的歌唱 时间: 2011-12-14 17:43

lifflefield 发表于 2011-12-14 14:45
各位，我又回来了很久不见了。基因治疗乙肝，已经论证为不靠谱的想法，实效太难
还是通过理论设计药物比 ...

楼主继续努力，咱们乙人的命，就拽在你们的手里

国内的研究，证明都是为了骗取经费或欺诈投资者的

期待海外华人或者国外研究者带来好的消息

作者: zongguo 时间: 2011-12-14 21:49

本帖最后由 zongguo 于 2011-12-14 21:50 编辑

lifflefield 发表于 2011-12-14 14:45
各位，我又回来了很久不见了。基因治疗乙肝，已经论证为不靠谱的想法，实效太难
还是通过理论设计药物比 ...

我们的生存，我们的希望就靠你们了，还是海外华人能干点实事，国内就一帮骗钱的骗子。
楼主有了解过加拿大REP 9AC这药吗？

作者: sqchh 时间: 2012-1-8 15:19

唉失望啊，又是药物控制，看到楼主说的现在的国际观点就是药物控制，这或者对国外来说是挺正常的。但你知道这句药物控制就行了在国内的份量吗？国内的乙人被歧视严重，工作也不好找，就算吃的国内恩替来控制，加上检查费等，起码1000一月。这对一个工作不稳定的人来说多不容易，何况还要一个人养两老人。医院专家当然说话不腰痛了，国内这么多乙人，这要贡献多少收入，试问乙肝的药物降过价吗？试问出了国产药后比国外药能便宜了多少，我告诉你，就便宜了30%吧（还有你知道国内假药多猖狂吗？动则100多200元的7天药量会是多大的造假诱惑啊，所以我还是选择了大医院的国外药，这要贵多少啊），试问这么庞大的用药进了医保了吗？乙人在国内就是水深火热的生活，，这并不是你等随便说出药物已经能很好控制的人所能体会到的

作者: zongguo 时间: 2012-1-8 18:44

sqchh 发表于 2012-1-8 15:19
唉失望啊，又是药物控制，看到楼主说的现在的国际观点就是药物控制，这或者对国外来说是挺正常的。但你知道 ...

国内的乙人确实很悲惨，期盼特效药出现

作者: 爱唱歌的猪 时间: 2012-1-12 18:31

说吧，你要坛子里能给你什么样的支持？？？

或许大家组织下就搞定了。

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